脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)是生物体的主要遗传物质,由脱氧核糖及四种含氮碱基组成。UV照射、X射线、病毒、药物等的刺激可以使DNA发生损伤,出现替换、删除、插入、倒位等现象,使得DNA功能失常,引发各种机体应答。DNA损伤的蓄积能够引起细胞死亡、组织损伤和功能障碍、免疫系统紊乱、干细胞再生能力下降、诱发癌症等疾病。因此,深入研究DNA损伤应答通路具有重要的生物学意义。p53是一个重要的转录因子,参与调节机体重要生理和病理过程,包括细胞生长、细胞分化、细胞衰老、细胞凋亡、免疫应答、肿瘤发生等。正常情况下,p53的表达水平非常低;在受到体内外刺激,如缺氧、DNA损伤、原癌基因表达时,p53在体内大量表达,引发多种生物学反应,从而发挥免疫监视及基因组守护者的作用。p53拥有众多靶基因,其中包括细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p21。当发生DNA损伤时,p53被激活,启动p21的大量表达。p21可与cyclin-CDK复合物结合,抑制复合物的酶活性,从而导致细胞周期停滞,使受损DNA不能复制。但目前对p53的研究主要为哺乳动物p53,鸡源p53的研究非常少。且目前尚无有效的鸡源p53和p21检测抗体。本研究以PCR方法扩增出鸡源p53及p21基因,并诱导表达出目的蛋白,利用单克隆抗体制备技术,成功制备出能特异性检测鸡源内源性及外源性蛋白的单克隆抗体。具体研究内容主要包括以下两部分内容:1.鸡源p53单克隆抗体制备提取CEF细胞RNA,反转录获得其cDNA。以此cDNA为模板,利用PCR技术扩增鸡p53基因,并将其连入原核表达载体pET-30a中,获得重组质粒pET-30a-p53。将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,在诱导剂IPTG的作用下表达目的蛋白,利用SDS-PAGE凝胶电泳对表达产物进行可溶性分析。结果显示,鸡源p53蛋白同时存在于上清及包涵体中,其中包涵体含量较多;用目的蛋白制备抗原,腹腔免疫Balb/C小鼠,利用IFA、ELISA以及WB等试验方法对获得的多抗血清进行检测,结果表明多抗血清具有良好的特异性;利用单克隆抗体制备技术筛选出6株阳性细胞株,即1D7、3C4、4D4、4F6、4F7和4H2,鉴定亚型为IgG型。用大量扩增的1D7细胞株免疫小鼠,制备腹水。2.鸡源p21单克隆抗体制备通过常规PCR技术,扩增出鸡源p21基因,并与原核表达载体pET-30a相连接,构建重组质粒pET-30a-p21。将获得的重组质粒转化入BL21感受态细胞,在IPTG的诱导下,表达出目的蛋白。将表达产物进行SDS-PAGE凝胶电泳,分析其可溶性并分离目的蛋白。将目的蛋白制备的抗原免疫Balb/c小鼠,眼球摘除分离多抗血清,用IFA、ELISA以及WB对多抗血清进行检测,结果表明多抗血清特异性良好。选取效价最高的小鼠脾脏与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。经不断筛选,共获得了 12株阳性杂交瘤细胞株,即 1B12、1E12、1H7、2B5、2C5、2C8、2D8、2F2、3C11、3D6、3G7 和4G6,亚型鉴定结果为IgG型。利用IFA、ELISA和WB对获得的单抗进行检测,成功制备了特异性鸡p21单抗。