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目的糖尿病(diabetes mellitus,DM)是危害人类健康的主要疾病,近年来,其发病率呈现不断上升趋势。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最重要的微血管并发症之一,并且严重影响糖尿病患者的生活质量。Corin是一种Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶,主要特异性表达于心脏,但在肾脏、子宫、胎盘、骨等多组织系统也有Corin的表达。Corin能切割心房钠尿肽前体(pro-atrial natriuretic peptide,pro-ANP),并将其活化为心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP),产生的ANP具有生物学活性。有研究表明,Corin可参与多种肾脏疾病的发生。在慢性肾病患者中,尿Corin水平与肾脏Corin表达水平均明显下降;在伴有蛋白尿的肾脏疾病中,Corin水平下降可引起水钠潴留。在肾病综合征大鼠动物模型及Corin基因敲除小鼠中均可见Corin水平下降可引起水钠潴留。但是,Corin在糖尿病肾病发病中的作用尚未阐明。因此,本文旨在通过高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞株,采用si RNA技术、Real-time PCR、RT-PCR、Western blot以及免疫荧光等相关细胞与分子生物学技术,探讨Corin在糖尿病肾病中的作用,以期阐明糖尿病肾病发病的新的分子机制并发现防治新靶点。方法1.RT-PCR检测高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞株Corin和ANP m RNA水平的表达,并以高渗透压组(OC)及正常浓度糖对照组(Ctrl)为对照。2.Western blot检测高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞株Corin和ANP蛋白的表达,并以OC组及Ctrl组为对照。3.免疫荧光染色方法检测高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞株Corin表达水平,并以OC组及Ctrl组为对照。。4.构建Corin-si RNA HK-2细胞,RT-PCR鉴定Corin-si RNA的HK-2细胞Corin基因干扰效率。5.Western blot进一步验证Corin-si RNA的HK-2细胞Corin基因干扰效率。6.普通光学显微镜下观察Corin-si RNA HK-2细胞的增殖情况。7.MTT比色法与台盼蓝染色方法检测Corin-si RNA HK-2细胞的增殖情况与活力。8.内皮细胞划痕实验检测Corin-si RNA HK-2细胞上清液对EA.hy926内皮细胞损伤修复的影响。结果1.高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞株Corin及ANP m RNA表达水平与Ctrl、OC组相比均降低。2.高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞株Corin和ANP蛋白表达水平与Ctrl、OC组相比均降低。3.免疫荧光染色(IF)结果表明,与Ctrl、OC组相比,高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞株Corin表达水平显著下降(P<0.05)。4.导入HK-2细胞中的Corin-si RNA序列1和序列2对Corin基因的干扰效率分别为45.45%、44.18%(P<0.01)。5.与NC-si RNA组相比较,导入Corin-si RNA序列1和序列2的HK-2细胞Corin蛋白水平表达均明显下降。6.与NC-si RNA组比较,Corin-si RNA HK-2细胞的增殖均明显被抑制。7.与NC-si RNA组比较,Corin-si RNA HK-2细胞增殖能力明显下降(P<0.01),Corin-si RNA HK-2细胞活力亦明显降低(P<0.01)。8.与Ctrl和NC-si RNA组比较,Corin-si RNA HK-2细胞培养上清使EA.hy926内皮细胞受损后修复能力受损。结论1.成功构建了Corin缺失的HK-2细胞模型;2.Corin和ANP对肾脏具有保护性作用;3.HK-2细胞Corin缺陷影响EA.hy926内皮细胞损伤后的修复功能;4.Corin缺失参与了糖尿病肾病的内皮功能紊乱的发生;5.在糖尿病肾病中Corin介导的pro-ANP活化途径十分重要。