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家蚕(Bombyx mori),又名桑蚕,属鳞翅目家蚕蛾科,是迄今为止数百万种昆虫中仅有的被驯化并大规模人工饲养的经济昆虫。其幼虫具有一对发达的绢丝腺,能够大量合成分泌丝蛋白。近几年,以转基因家蚕表达外源蛋白的研究较为常见,但也有许多用转基因家蚕研究家蚕发育的报道。本研究以家蚕热休克蛋白20.4基因启动子(heat shock promoter 20.4)、杆状病毒egt基因(Ecdysone UDP-glucosyl transferase,EGT)构建新的基于piggyBac转座子的家蚕转基因载体。克隆hsp20.4启动子、杆状病毒egt基因(Ecdysone UDP-glucosyl transferase,EGT),并以生物信息学手段分析hsp20.4启动子元件和egt基因;构建hsp20.4启动子控制红色荧光蛋白(Discosoma red fluorescent protein, DsRed/drFP583)报告基因的瞬时表达载体,进行家蚕体内及BmN培养细胞中的瞬时表达试验;构建hsp20.4启动子控制的egt基因的瞬时表达载体,在蚕蛹中进行表达。构建以hsp20.4启动子控制外源基因egt的转基因载体,以转基因载体进行家蚕培养细胞的转基因研究并进行家蚕转基因的初步研究。研究结果得到了hsp20.4启动子片段(GenBank登录号:EU350579)、杆状病毒egt基因片段(GenBank登录号:EU350576)。瞬时表达证明克隆的hsp20.4启动子通过高温诱导,在家蚕组织和培养的家蚕细胞中有良好的启动活性;egt基因的表达产物可以延缓蚕蛹的发育。以克隆的元件构建新的转基因载体,除了已有的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)报告基因外,还含有hsp20.4启动子和杆状病毒egt基因片段、IE-NEO片段。以转基因载体转化家蚕BmN细胞,以终浓度800μg/mL的G418(Geneticin)筛选1个月,获得稳定转化细胞,呈现绿色荧光细胞数约70 %,SDS-PAGE分析可以发现EGT蛋白的特异性条带(约55KD)。以转基因载体进行初步的家蚕转基因试验,幼虫5龄1 d观察到2条蚕体表具有绿色荧光斑点。对克隆的egt基因片段进行相关的信息学分析发现杆状病毒的egt基因起源于antennal-enriched型UGT基因,而NPV的egt基因起源于GV的egt基因。构建了pigA3GFP-En-IE-NEO-hsp20.4-IT3-PA。本研究构建的转基因载体可促进转基因控制家蚕发育的深入研究。