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[研究目的]研究益气解毒方(YQ)联合盐霉素(SAL)对鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制效应以及诱导凋亡效应,并初步探讨其抑制增殖的作用机制。[研究方法]1.MTT试验检测不同浓度梯度的YQ和SAL单用及联用干预对数生长期的鼻咽癌CNE-2、5-8F、6-10B细胞72h后,对鼻咽癌细胞的细胞存活率的影响,并于显微镜下观察细胞形态变化;2.细胞平板克隆形成试验检测不同浓度梯度的YQ和SAL单用及联用干预对数生长期的鼻咽癌CNE-2、5-8F和6-10B细胞14天后,对鼻咽癌细胞克隆形成率的影响;3.线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测不同浓度梯度的YQ、SAL单用及联用干预鼻咽癌CNE-2和5-8F细胞株48h后,根据鼻咽癌细胞的红/绿荧光细胞比值和细胞线粒体膜电位改变的情况,观察药物对细胞凋亡的影响;4.划痕实验和Transwell体外迁移实验检测不同浓度梯度的YQ、SAL单用及联用24h后,对鼻咽癌CNE-2和5-8F细胞株细胞迁移能力的影响;5.Transwell体外侵袭实验检测不同浓度梯度的YQ、SAL单用及联用干预对数生长期的CNE-2和5-8F细胞24h后,穿透基质膜,侵袭到Tanswell小室底膜下室面的细胞数,分析药物对细胞侵袭能力的影响;6.流式细胞术分析YQ、SAL单用及联用对鼻咽癌细胞系CNE-2、5-8F细胞周期的影响;7.Western Blot法检测不同浓度的YQ、SAL单用及联用干预对数生长期的CNE-2和5-8F细胞48h后,细胞周期相关蛋白CyclinD1、CyclinD3、CDK2、CDK4、CDK6、P21和P15的表达情况,以初步分析抑制细胞增殖的机制。[研究结果]1.YQ联用SAL抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡(1)与溶剂对照组比较,单用yq和sal均使细胞存活率显著降低,差异均具有统计学意义(p<0.01)。yq(0.625mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml)分别联用1.25μmol/lsal(细胞存活率分别为37.1%、16.4%和12.8%)、2.5μmol/lsal(细胞存活率分别为38.7%、23.9%和17.7%)、5.0μmol/lsal(细胞存活率分别为27.3%、14.5%和13.5%),细胞存活率显著降低,与药物单用组比较,差异均具有统计学意义(p<0.01)。(2)单用0.5μmol/lsal处理cne-2、5-8f和6-10b细胞后,细胞克隆集落数量明显减少,克隆形成率降低,分别为溶剂对照组的70%、60%、50%,与溶剂对照组相比,差异均具有统计学意义(p<0.01)。单用0.05mg/ml、0.1mg/ml的yq处理cne-2(克隆形成率分别为80.6%与62%);0.025mg/ml、0.05mg/ml的yq处理5-8f(克隆形成率分别为56%、15%)和6-10b(克隆形成率分别为80%、25%)细胞,克隆形成率显著降低,与溶剂对照组相比,差异均具有统计学意义(p<0.01)。联用0.5μmol/lsal和0.05mg/ml、0.1mg/ml的yq处理cne-2(克隆形成率分别为48%和35%)、联用0.5μmol/lsal和0.025mg/ml、0.05mg/ml的yq处理5-8f(克隆形成率分别为5%和2%)和6-10b(克隆形成率分别为3%和2%),细胞克隆形成率较单用sal组和溶剂对照组均显著降低(p<0.01)。(3)细胞凋亡检测发现:相比溶剂对照组,单用yq和sal均能显著降低cne-2和5-8f细胞线粒体膜电位、诱导细胞凋亡,差异均有统计学意义(p<0.01)。与溶剂对照组(红色/绿色荧光的比值为4.92)和sal药物单用组(红色/绿色荧光的比值为3.59)比较,yq(1.25、2.5mg/ml)和sal(1.25μmol/l)联合用药组能显著降低cne-2(红色/绿色荧光的比值降为0.68和0.47)细胞线粒体膜电位、诱导细胞凋亡;yq(1.0、2.0mg/ml)和sal(1.25μmol/l)联合用药组能显著降低5-8f(红色/绿色荧光的比值降为0.58和0.36)细胞线粒体膜电位、诱导细胞凋亡。差异均有统计学意义(p<0.01)。2.yq水提物联合sal抑制鼻咽癌细胞迁移和侵袭(1)cne-2和5-8f细胞在划痕后24h均能迅速迁移,其中cne-2细胞几乎将划痕区填满。与溶剂对照组比较,单用sal和yq细胞相对迁移率显著降低,两者都显著抑制了细胞迁移,差异有统计意义(p<0.01)。联用1.25μmol/lsal和1.25mg/ml、2.5mg/ml的yq处理cne-2(细胞迁移率分别为16.9%和11.9%),联用1.25μmol/lsal和1.0mg/ml、2.0mg/ml的yq处理5-8f(细胞迁移率分别为16.5%和6.6%),细胞迁移率较单用sal组(cne-2细胞的为31.8%,5-8f细胞的为35.2%)和溶剂组均显著降低(p<0.01),且随着yq浓度的升高迁移抑制作用加强。(2)相对溶剂对照的迁移细胞数,单用1.25μmol/lsal和1.25mg/ml、2.5mg/ml的yq处理cne-2细胞后,迁移到transwell小室底膜下室面的细胞数目和相对于溶剂组的细胞迁移率显著降低(细胞迁移率分别为45.6%、42.3%和26.8%),单用1.25μmol/lsal和1.0mg/ml、2.0mg/ml的yq处理5-8f细胞后,相对溶剂组的细胞迁移率显著降低(细胞迁移率分别为50.8%、35.7%和18.4%),差异均有统计学意义(p<0.01)。联用1.25μmol/lsal和1.25mg/ml、2.5mg/ml的yq处理cne-2(细胞迁移率分别为22.1%和12.7%),联用1.25μmol/lsal和1.0mg/ml、2.0mg/ml的yq处理5-8f(细胞迁移率分别为19.5%和11.7%),较单用sal组和溶剂组均显著降低(p<0.01),且随着yq浓度的升高迁移抑制作用加强,呈现显著浓度依赖性。(3)相对溶剂对照组的侵袭细胞数,单用1.25μmol/lsal和1.25mg/mlyq处理细胞后,穿过基底膜侵袭到transwell小室底膜下室面的cne-2细胞数目和相对于溶剂组的细胞侵袭率(细胞侵袭率分别为46.6%、43.8%),较溶剂组显著降低,差异均有统计学意义(p<0.01);联用1.25μmol/lsal和1.25mg/mlyq处理cne-2(细胞侵袭率为21.9%),细胞侵袭率较单用sal组和单用yq组和溶剂组均显著降低(p<0.01)。3.yq水提物联合sal抑制鼻咽癌细胞增殖的机制(1)流式细胞仪检测结果显示:单用yq处理鼻咽癌细胞,随着yq浓度的增高,g0/g1期的细胞减少、s期和g2期细胞增多;单用sal细胞周期没有发生显著变化;yq和sal联合作用于鼻咽癌cne-2和5-8f细胞系,结果均显示在一定浓度范围内g0/g1期细胞逐渐减少,s期和g2/m期细胞增加。(2)westernblot检测细胞周期调控蛋白表达水平显示,单用sal和yq处理CNE-2和5-8F细胞48h后,细胞周期蛋白CyclinD1、CyclinD3、CDK2、CDK4、CDK6、P21的表达下调,P15的表达有增加,且都具有一定浓度依赖性。联合SAL和YQ处理CNE-2和5-8F细胞后,CyclinD1、CyclinD3、CDK2、CDK4、CDK6、P21表达下调及P15表达上调更为显著。[结论]YQ水提物联合SAL能协同抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭和诱导细胞凋亡,这可能通过影响细胞周期相关蛋白CyclinD1、CyclinD3、CDK2、CDK4、CDK6、P21、P15的表达,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,从而发挥抑制细胞增殖的作用。