【摘 要】
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目的:随着中国城乡居民群众物质生活水平快速的发展以及生活方式的快速改善,近年来高尿酸血症人群的总体发生率正在逐渐迅速增加。高尿酸血症病（HUA）主要是一类由嘌呤代谢紊乱症引起的代谢性疾病。尿酸在人体代谢中主要经由肾脏途径,且以肾小管上皮细胞为主,人体内的重吸收与代谢主要取决于尿酸盐转运蛋白,而其驱动力则来自于肾小管上皮细胞基底膜上的钠钾ATPase（Na+-K+-ATPase,NKA）。NKA最早
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目的:随着中国城乡居民群众物质生活水平快速的发展以及生活方式的快速改善,近年来高尿酸血症人群的总体发生率正在逐渐迅速增加。高尿酸血症病（HUA）主要是一类由嘌呤代谢紊乱症引起的代谢性疾病。尿酸在人体代谢中主要经由肾脏途径,且以肾小管上皮细胞为主,人体内的重吸收与代谢主要取决于尿酸盐转运蛋白,而其驱动力则来自于肾小管上皮细胞基底膜上的钠钾ATPase（Na+-K+-ATPase,NKA）。NKA最早被发现是作为离子泵参与转运细胞内外的Na+和K+,使细胞膜两侧离子浓度及电位差趋于平衡,并保持动态稳定。既往研究发现,NKA还可具有信号传递调控功能,通过激活不同通路的蛋白激酶参与细胞间信号的传递,维持机体的正常生命和细胞内环境的稳态,其功能障碍在慢性高血压、心血管疾病和慢性肾脏病等心脑血管疾病发展研究中均起重要作用。在尿酸性肾损伤中机制尚不明确的情况下,本研究拟探讨不同尿酸浓度对肾小管上皮细胞NKA的影响及其可能的机制,为临床监测、早期预防和治疗高尿酸血症提供理论依据。方法:1、实验对象为人的肾小管上皮细胞（HK-2）,使用CCK-8细胞毒性试验进行测定,并选取最适宜的尿酸作用浓度,在倒置显微镜下观察细胞的形态。2、配置可溶性尿酸溶液,设立0-16mg/dl浓度梯度组,分别刺激24-72h时长的HK-2细胞,设立药物干预组对照试验,在活性氧反应最强组加入活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）进行对照。在倒置荧光显微镜下观察使用活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）试剂盒检测每组细胞的总ROS表达情况。3、配置各浓度（0、4、8、12、16 mg/dl）的尿酸,并分别作用于HK-2细胞约四十八小时,ELISA法检测各组细胞细胞内ATP产生和NKA活性改变,选择反应最强尿酸浓度组分别作用细胞1小时、6小时、24小时、48小时,平行对照检测各组细胞内ATP产生和NKA活性改变。4、配置不同浓度（0、4、8、12、16 mg/dl）的尿酸,细胞膜片钳技术测定各组实验细胞静息电位。5、配置不同浓度（0、4、8、12、16 mg/dl）的尿酸以及药物干预组A（cont+活性氧抑制剂NAC）和B（16mg/dl+活性氧抑制剂NAC）,分别作用于HK-2细胞48小时,Western blotting法分别检测NKAα1亚基和酪氨酸蛋白激酶（Protein Tyrosine Kinase,Src）的表达。结果:1、经CCK-8细胞毒性实验检测及倒置显微镜观察,实验组设置的尿酸浓度对肾小管上皮细胞增殖没有显著影响。2、4 mg/dl中的尿酸组HK-2与对照组数据相比较,ROS反应强度无明显差异,8-16mg/dl的尿酸组中HK-2细胞的ROS则反应强度明显增强;药物干预组（16mg/dl+NAC）HK-2的ROS的产生较16mg/dl实验组明显减少。3、与对照组及4mg/dl尿酸组HK-2细胞相比,8-16 mg/dl尿酸组HK-2 NKA活性表达呈时间依赖性下降;与对照组相比,12mg/dl尿酸组在1-24 h内NKA活性呈时间依赖性下降趋势显著增加,直到48 h才开始下降。与对照组（0mg/dl尿酸组）相比较,4-16mg/dl尿酸组ATP呈剂量依赖性降低;与对照组相比较,12mg/dl尿酸组在培育1小时,6小时,24小时后,ATP呈时间依赖性降低;48小时与24小时组无明显改变。4、与对照组相比较,4、8、12和16mg/dl尿酸组静息电位绝对值逐渐降低。5、同对照组细胞相比较,4 mg/dl UA组和药物干预A组HK-2细胞中的NKAα1亚基的表达并无明显地改变趋势,而8-16mg/dl尿酸组HK-2细胞的NKAα1表达呈浓度依赖性降低;同16mg/dl尿酸组相比,药物干预B组HK-2细胞内的NKAα1表达水平明显受到抑制。同对照组相比较,4 mg/dl UA组和药物干预A组HK-2细胞中的Src表达基本无明显的差异,而8-16mg/dl尿酸组HK-2细胞内的Src表达呈时间依赖性增强;与16mg/dl相比,药物干预B组HK-2细胞的Src表达明显降低。结论:高浓度的尿酸可能通过刺激细胞氧化应激反应抑制肾小管上皮细胞NKAα1亚基的表达,导致NKA活性受损,进而激活NKAα1/Src信号转导,诱导Src高表达导致肾小管功能损伤。
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