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目的共济失调毛细血管扩张突变(ATM)作为一种抑癌基因,参与细胞周期调控,细胞损伤与细胞修复等多个DNA损伤修复过程,其突变与肿瘤的发生密切相关。近年来,有研究发现ATM基因在人类多数癌症中均有突变,如:结肠癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌等。并且,越来越多的研究证实ATM低表达的实体瘤患者对PARP抑制剂奥拉帕尼的敏感性明显增强。鉴于ATM基因在DNA损伤修复过程中的关键作用,本实验通过实时定量RT-PCR技术及蛋白印迹技术检测四个结肠癌细胞系中ATM m RNA与蛋白的表达情况,并筛选出ATM低表达的细胞系。将奥拉帕尼作用于目的细胞系后,观察奥拉帕尼对细胞增殖、细胞凋亡、细胞侵袭及迁移、克隆形成的影响。方法1.通过使用实时定量RT-PCR(real-time reverse transcription and polymerase Chain reaction,RT-PCR)技术检测ATM基因在结肠癌HCT116,HCT8,HT29和SW480四个细胞株中m RNA的表达水平。通过蛋白印迹(Western blot)技术检测ATM在HCT116,HCT8,HT29和SW480四个结肠癌细胞株中蛋白的表达水平,最终确定试验所用的细胞株。2.随后,用不同浓度的奥拉帕尼(12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L和200μmol/L)分别处理ATM低表达的结肠癌细胞株(HCT116),24、48、72小时后通过四甲基偶氮唑(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)法计算细胞的增殖抑制率。最后,通过SPSS17.0软件计算Olaparib的IC50值。3.ATM低表达的结肠癌细胞株随机分成两组,一组为奥拉帕尼实验组,一组为空白对照组,空白对照组为自然培养的结肠癌细胞株,不做任何处理。根据奥拉帕尼的IC50值,确定三个奥拉帕尼的药物梯度,分别为:50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L。不同浓度的奥拉帕尼分别作用于实验组的细胞株48h后,通过MTT法、克隆形成试验检测各组细胞在体外的增殖能力,Transwell小室实验检测各组细胞的侵袭及迁移能力。结果1.RT-PCR及蛋白印迹结果显示人结肠癌细胞HCT116,HCT8,HT29,SW480中均有ATM m RNA及蛋白的表达,但HCT116细胞m RNA及蛋白表达水平相比其他细胞明显减低。所以,我们筛选HCT116细胞做后续的功能试验。2.药筛试验结果回报:奥拉帕尼作用于HCT116结肠癌细胞株48h的IC50值为99.01±0.4μmol/L。3.MTT法显示:奥拉帕尼实验组细胞(50umol/L、100umol/L、200umol/L)作用48h的OD490值分别为:0.42±0.030、0.34±0.002、0.29±0.006,调零孔的OD值为0.041±0.003,均低于空白对照组的OD490值0.764±0.004,差别具有统计学差异(P<0.05)。4.平板克隆形成实验法显示:奥拉帕尼实验组的克隆形成能力明显低于对照组,实验组的细胞生长明显受到抑制,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。5.Transwell实验显示:实验组细胞的迁移及侵袭能力较对照组明显下降,差异同样具有统计学意义(P<0.05)。结论1.四个结肠癌细胞中均有ATM的表达,但各细胞株中的表达水平明显不同,可以通过RT-PCR与Western技术筛选出ATM低表达的结肠癌细胞株。2.通过MTT法计算出ATM低表达结肠癌细胞株的IC50值,为后续的功能实验提供一定参考。3.奥拉帕尼作用于ATM低表达的结肠癌细胞,可以抑制细胞的生长增殖,促进细胞的凋亡,下调细胞的侵袭和迁移能力,降低细胞的克隆形成能力。4.总之,ATM低表达的结肠癌细胞对奥拉帕尼的敏感性明显增强。