结肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，具有发病率高、病理类型复杂多样、转移早和早期诊断率低等特点。在美国，其发病率占恶性肿瘤的第3位，死亡率居恶性肿瘤的第2位。近20年来，我国大肠癌发病率明显上升（达13.29/10万），并以每年4.2%的速度上升，目前在我国大中城市，结肠癌的发病率和死亡率居恶性肿瘤的第3位。在治疗方面，传统的手术+放疗+化疗依然是治疗胃肠道肿瘤的主要措施，但长期生存率并未得到显著提高，其五年生存率仍徘徊在30-66%之间。近年来，随着研究的深入，新型的基因及免疫治疗策略逐渐在恶性肿瘤的临床治疗中崭露头角，通过应用生物反应调节剂和细胞因子等充分调动机体的固有免疫和适应性免疫，以及过继性免疫治疗的方法也日渐受到广泛关注，成为胃肠道肿瘤治疗的重要研究方向之一。但由于对恶性肿瘤的免疫逃逸机制及机体的抗肿瘤免疫机制认识有限，目前尚缺乏有效的结肠癌免疫治疗方法。肿瘤的发生与机体的免疫监视功能失调有密切关系。研究发现，在许多肿瘤的发生过程中，肿瘤细胞具有一定的免疫原性并能诱导产生免疫反应，由于机体免疫系统存在某些复杂机制，最终致使自身的抗肿瘤免疫效能低下，这些机制包括：宿主抗原提呈细胞（APC）功能的缺失、肿瘤细胞下调MHCⅠ类分子表达水平、T细胞对自身抗原具有耐受性、调节性T细胞对抗肿瘤反应的抑制作用以及肿瘤细胞可表达凋亡配体（Fas Ligand）或抑制性细胞因子等。此外，另一个致使肿瘤患者免疫无能的重要因素在于：初始抗肿瘤适应性免疫反应一般发生在二级淋巴器官内(secondary lymphoid organs，SLOs，包括：淋巴结、Peyer’s patch、脾脏、NALT等)，而免疫系统对定位于二级淋巴器官之外的肿瘤产生了免疫忽视，而肿瘤组织所具有的各类基质细胞屏障，进一步阻止了各种免疫细胞和效应分子进入肿瘤实质内，从而最终逃脱了免疫系统的杀伤作用。三级淋巴器官（Tertiary lymphoid organs,TLOs）,也称为异位淋巴组织（Ectopiclymphoid tissues，ELTs）。是指在某些病理情况下，出现了不属于经典二级淋巴器官的其他淋巴样组织；这类淋巴样组织最初是在由微生物感染所导致的慢性炎症反应及某些自身免疫性疾病中被发现（例如风湿病患者的关节滑膜组织）。而这些淋巴样组织又不同于区域淋巴结或粘膜下淋巴组织（如Peyer’s patch），它们常出现在机体的炎症反应部位的组织中，因此被称为“异位”淋巴组织。异位淋巴组织在大体结构上与典型的二级淋巴器官高度类似，除不具备包膜，它具有生发中心（GC）、淋巴滤泡、B细胞及T细胞聚集区、滤泡状DC、DC、高度分化的基质细胞及典型的高内皮小静脉（High endothelial venules, HEVs）等二级淋巴器官的特征性组织结构；另外，由三级淋巴器官所产生的趋化因子及其他效应分子也与经典的二级淋巴器官相同。由于TLO具备上述各种特征，因而在功能上，它可为特异性T、B淋巴细胞的适应性免疫反应提供所需场所和各种必要条件，包括初始T淋巴细胞的发育成熟、活化、及各种效应性T细胞亚群的终末分化，以及各类生发中心反应如免疫球蛋白类别转换和体细胞高频突变及等一系列过程均可在TLO中完成。重要的是，TLO无被膜，各种淋巴细胞、细胞因子或其他效应分子可迅速地通过高内皮小静脉穿梭于组织和血管之间。由于具备上述结构和功能特点，TLO在自身免疫性疾病、慢性炎症及移植物排斥反应过程中发挥了重要作用。之前的研究结果及数据分析均提示：如果能够通过某些方法吸引并招募各类免疫细胞在肿瘤组织内聚集，进一步诱使肿瘤实质内部形成TLO组织，便可在肿瘤局部形成一个能够充分启动细胞和体液免疫的淋巴组织样微环境，必将为打破机体免疫系统对肿瘤的免疫忽视及免疫耐受，进而启动有效的抗肿瘤免疫提供有力措施。研究发现，在外周淋巴结和脾脏等SLO的分化发育过程中，淋巴毒素(LT)类分子：LT-α和LT-β在其中起了至关重要的作用，尤其是LT-α的作用更为关键。例如，LT-α基因敲除的小鼠，将会缺失所有的外周淋巴结及肠粘膜下派氏淋巴结，而脾脏的结构也发生了巨大改变，失去了典型的功能区；而将LT-α转基因表达后，可以使LT-α基因缺陷小鼠恢复部分SLO的结构和功能。但由于目前对于三级淋巴器官与肿瘤关系的研究极少，通过细致文献回顾，我们发现国际上仅有的报道也只是在某些肿瘤组织中发现了类似三级淋巴组织的存在（例如乳腺导管癌和非小细胞肺癌），此外，有研究使用融合蛋白或基因修饰方法诱导TLO在肿瘤中形成并证实其具有抗肿瘤作用。然而，迄今为止，我们仍无法回答下列问题：1.三级淋巴组织是否普遍存在于肿瘤组织？2.能否在肿瘤实质内诱生免疫功能更完备且强大的三级淋巴组织?3.三级淋巴组织在肿瘤内形成能否有利于肿瘤抗原提呈和各种淋巴细胞的浸润，从而打破各种肿瘤免疫屏障?而如果在肿瘤内部形成的TLO组织确实具有抗肿瘤活性，这种抗肿瘤作用是通过怎样的机制实现的？为了解决上述问题，本研究拟通过LT-α基因转染结肠癌细胞，在肿瘤局部建立稳定高水平表达LT-α的小鼠结肠癌肿瘤模型，观察LT-α的表达是否能够诱导结肠癌瘤内TLO形成，并研究其对肿瘤生长方式、生长速度、转移及模型存活率等肿瘤生物学特征的影响，在此基础上，深入研究瘤内TLO形成对各种在肿瘤免疫中具有重要作用的趋化因子和细胞因子的调节作用，探讨将LT-α作为诱导肿瘤TLO形成和抗肿瘤治疗方法的可行性，为寻找新型结肠癌临床免疫治疗策略提供理论依据。通过对本课题的研究，我们得到的主要结果如下：（1）成功构建了LT-α基因的小鼠结肠癌C26稳转细胞系在本研究中，为了验证LT-α是否能在肿瘤局部诱导生成TLO组织，必须首先建立能稳定表达LT-α基因的小鼠结肠癌细胞系，这是研究的基础和必要条件之一，如果不能建立LT-α稳转细胞系，那么所有后续研究将无从谈起。因此，在第一部分研究中，我们采用慢病毒感染的方法，将LT-α基因转入小鼠结肠癌细胞系C26中，并通过荧光显微镜和WB进行验证。证明转染成功，转染后的C26细胞可稳定地表达出LT-α功能蛋白。（2）成功构建了小鼠荷瘤模型将LT-α基因转入小鼠结肠癌细胞系C26并经验证转染成功后，分别用C26细胞和C26-LT-α细胞及C26-空载体细胞建立肿瘤模型，在Balb/c小鼠腋下皮下接种肿瘤细胞，分组进行处理。我们发现，C26-LT-α组小鼠存活期延长，与其他对照组相比肿瘤生长缓慢，肿瘤体积较小且在肿瘤内部出现大片的肿瘤坏死区域。实验结果提示我们LT-α在肿瘤内局部稳定表达抑制了肿瘤的生长过程，促进肿瘤坏死。（3）证实了LT-α可在肿瘤内诱发TLO组织为了分析C26-LT-α组小鼠肿瘤生长受到抑制是否是因为LT-α的表达诱导TLO形成所致，我们对肿瘤组织标本进行了切片，用HE染色和免疫组化染色深入分析了各种细胞标志物和血管标志物的表达，判断TLO是否在瘤内形成，通过实验，我们发现，在实验组小鼠的肿瘤组织内部边缘位置有类似于淋巴滤泡的组织形成，经免疫组化染色，发现这些疑似淋巴滤泡的组织中为大量的B淋巴细胞聚集所致，在此基础上，通过对各种HEV标志物的染色，我们确定了HEV在肿瘤内形成，并且在这些淋巴滤泡当中有大量的FDC存在，据此，我们判断TLO可在稳定表达LT-α的肿瘤组织内部形成。而TLO的形成，招募了大量淋巴细胞进入肿瘤内部，有效地抑制了肿瘤的生长，延长了小鼠的生存期。