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目的下丘脑腹外侧视前区（ventrolateral preoptic nucleus，VLPO）与结节乳头体核（tuberomammillary nucleus，TMN）分别是促睡眠中枢和促觉醒调节中枢之一。约80%的VLPO神经元为γ-氨基丁酸（GABA）能神经元和甘丙肽能神经元，而TMN是脑中组胺能神经元胞体集中聚集的区域。本实验采用脑立体定位技术，核团内微量注射、冰冻切片等方法研究VLPO与TMN之间是否具有双向调节的直接通路。方法1.模型建立清洁级成年SD大鼠，雌雄不拘，体重250300g。戊巴比妥钠（50mg·kg–1）腹腔注射麻醉后，无菌手术操作暴露颅骨，将两个不锈钢引导管（22gauge）插入VLPO（AP：0.36mm；R：1.30mm；H：7.00mm）和TMN（AP：3.96mm；R：1.50mm；H：7.70mm）。注射荧光探针后，逐层缝合，送回动物室，自由饮水进食。术后将大鼠置于记录室中休息，待麻醉苏醒后观察动物行为活动。2.动物分组将SD大鼠随机分为对照组（TMN+ACSF&VLPO+ACSF组）与实验组（TMN+ACSF&VLPO+DiO组和TMN+DiO&VLPO+ACSF组）。3.药物微量注射使用Hamilton微量注射器（针尖直径26gauge）通过引导管向目的核团注射ACSF（对照组）或含荧光探针Fast DiO（激发波长488nm；发射波长，499nm)（实验组）3l，注射速度为1l·min–1，注射完毕滞针3min防止药液溢出。4.组织学鉴定大鼠术后72h后，行戊巴比妥钠（50mg·kg–1）腹腔注射麻醉并仰卧位固定于手术台上，暴露心脏，从心尖处灌注250ml生理盐水以及200ml4%多聚甲醛。灌注结束后完整取下脑组织并4%多聚甲醛固定24h，次日使用30%蔗糖PB溶液脱水至沉底。取各组大鼠的大脑的TMN和VLPO进行冰冻切片，片厚2025m，光学显微镜下观察引导管位置以及药物注射位点，仅对定位准确的大鼠进行实验数据的统计。荧光显微下观察Fast DiO标记的荧光效果并拍照。结果1.神经损伤严重程度评分（neurological severityscore，NSS）采用双盲法，在ACSF或荧光探针注入核团后2h和24h对各组大鼠进行NSS评分。麻醉良好的动物在注射过程中没有发生抽搐、呼吸紊乱等异常情况。术后24h所有大鼠评分已基本正常。2.荧光标记结果2.1TMN+ACSF&VLPO+ACSF组在TMN和VLPO脑区皆未检测到绿色荧光标记神经元。2.2TMN+ACSF&VLPO+DiO组TMN脑区可见明显的绿色荧光标记神经元，荧光均匀存在于细胞质膜中，成像清晰。TMN之外的区域鲜见绿色荧光标记。2.3TMN+DiO&VLPO+ACSF组VLPO脑区可见明显的绿色荧光神经元，荧光均匀存在于细胞质膜中，神经元细胞的荧光对比度高，容易辨认，但成像的密度较低。VLPO之外脑区未见荧光。结论VLPO有神经纤维投射至TMN，同时TMN有神经纤维直接投射至VLPO脑区，VLPO核团与TMN核团存在双向直接联系。