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Hepcidin是一类富含半胱氨酸残基的抗菌肽家族，现在已经被证实存在于多种鱼类中并且有多变体现象。Hepcidin具有广谱的抗微生物、抗病毒和肿瘤细胞的活性，还是维持机体铁稳态的重要的调控因子。鱼类Hepcidin在水产养殖中具有较广阔的应用前景。本研究通过分子生物学技术，从我国海水养殖斜带石斑鱼（Epinepheluscoioides）中获得抗菌肽Hepcidin基因，并揭示其表达特性，丰富我们对斜带石斑鱼先天免疫系统和先天免疫机制的认识。在此基础上，利用基因工程表达技术建立斜带石斑鱼Hepcidin的高效表达载体，研究其基因表达产物的抗菌活性，并研究口服灌胃表达产品对斜带石斑鱼的生理影响。主要研究成果如下:
1.克隆获得源于斜带石斑鱼Hepcidin基因序列。利用分子生物学技术从海水养殖斜带石斑鱼肝脏RNA中克隆获得3条Hepcidin基因变体，EC-Hepcidin1、EC-Hepcidin2和EC-Hepcidin3。通过RACE技术获得了这3条变体的全长cDNA序列。从斜带石斑鱼肝脏基因组DNA中克隆获得了这3条变体的基因组DNA序列以及EC-Hepcidin1和EC-Hepcidin3基因组DNA上游调控区序列。这3条Hepcidin变体基因序列和基因结构有很高的相似性，均由3个外显子和2个内含子组成。生物信息学分析表明这3条Hepcidin变体编码的多肽均由信号肽、前导肽和成熟肽组成。成熟肽中均含有4个半胱氨酸残基，并且处于保守位点上。
2.揭示了EC-HepcidinmRNA的体内组织器官分布和在病原诱导下的表达特性。利用Real-timePCR检测EC-HepcidinmRNA在斜带石斑鱼各组织器官中的分布，结果显示在所有测定的组织器官中均有检测到EC-Hepcidin的表达，其中肝脏的表达量最高，是在其他组织器官中表达量的3000-1000000倍。揭示了EC-Hepcidin是斜带石斑鱼肝脏特异性表达的基因。检测了细菌感染后斜带石斑鱼肝脏中EC-HepcidinmRNA的表达变化。健康的斜带石斑鱼在经过腹腔注射后，在细菌感染、福尔马林灭活菌刺激和生理盐水对照3个处理组中，肝脏EC-HepcidinmRNA均受到细菌和灭活菌不同程度的诱导而上调表达，分别在处理后12-24h及12h达到最高点。说明Hepcidin是斜带石斑鱼先天免疫的重要效应分子，可以在抵抗外界刺激的过程中起到重要作用，对机体起保护作用。
3.重组表达获得EC-proHep3原核表达产物，研究其体外抗菌活性和杀菌动力学曲线。优化条件得到pET-28a/EC-proHep3(Rosetta)原核表达体系，可获得可溶性重组蛋白EC-proHep3，经一次亲和纯化后即获得目的蛋白纯品，分子量为12kDa，产量32.4mg/L菌液。体外抗菌实验结果显示，原核表达EC-proHep3能选择性地抑制革兰氏阳性和阴性菌，杀菌动力学曲线显示12μM的纯化重组蛋白EC-proHep3能够在60min杀灭全部金黄色葡萄球菌，30min杀灭全部施氏假单胞菌。
4.揭示EC-Hepcidin蛋白体内组织器官分布特点。利用EC-proHep3重组表达纯化产物免疫Balb/c小鼠制备EC-proHep3多克隆抗体。通过间接ELISA法和westernblot法对抗体效价和抗体特异性进行检测，结果显示EC-proHep3多克隆抗体具有较高效价，可特异与EC-proHep3重组表达产物结合，满足后续实验需要。利用EC-proHep3抗体，通过SDS-PAGE、Westernblot检测了EC-Hepcidin蛋白体内组织器官表达情况，发现在肝脏和肠道可检测到Hepcidin蛋白。其中肝脏检测到前多肽原和前体肽蛋白两种形式的Hepcidin，而肠道检测到较多Hepcidin前体蛋白。
5.口服EC-proHep3重组纯化产物，分析鱼体免疫基因和铁调节相关基因mRNA表达情况，并揭示单次灌胃EC-proHep3不会对机体造成氧化损伤和组织结构损伤。使用Real-timePCR检测口服灌胃EC-proHep3重组纯化产物0h、3h、6h、12h、24h和48h免疫相关基因TNFα-1、TNFα-2、IL1β、IL8和P65在肠道器官中的表达状况，结果表明所测定的免疫相关基因的口服抗菌肽组与溶剂PBS组没有显著性差异。通过对肝脏和肠道铁代谢相关基因FerroportinmRNA的检测发现，肝脏中Ferroportin在3-24h呈现出先抑制而后逐渐升高的趋势，48h达到最高。肠道Ferroportin基因在3h被显著抑制，并继续呈现基因表达下调的趋势。通过血清MDA的检测和肠道组织切片HE染色观察得到，单次灌胃EC-proHep3蛋白100μg/尾，血清中MDA含量无显著变化，肠道组织结构未受到影响。