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研究背景及目的肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是世界上的最常见的恶性肿瘤之一,全球发病率居恶性肿瘤第6位；病死率居第3位。每年新增病例达62.6万,其中超过半数来自中国,中国的肝癌患者大多有肝炎背景。趋化因子作为炎症反应中重要调节因素之一,除了参与调节炎症细胞向炎症部位的迁移及其它机体的免疫反应外,还与肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关。白介素8(Interleukin 8, IL-8)是慢性炎症反应中常见的趋化因子,在调节局部炎症反应中起重要作用。肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α)是肿瘤微环境常见的促炎细胞因子,具有强大的促进炎症反应作用,是炎症反应中重要的调节因子。本研究选用了人肝癌细胞系MHCC-97H,首先检测其是否分泌IL-8及TNF-α对其分泌IL-8的影响,进而探讨了p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 Mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK)、细胞外调节蛋白激酶(Extracellular Regulated Protein Kinases, ERK)和PI3K/Akt (Phosphoinositide 3-kinase/Protein Kinase B, PI3K/Akt)信号通路是否参与了MHCC-97H分泌IL-8的调节,p38 MAPK是否通过NF-κB通路调节IL-8的分泌,以及CCR1, CCR2和CCR3信号通路对IL-8分泌的影响。研究方法通过酶联免疫吸附(ELISA)检测MHCC-97H细胞未干预及TNF-α干预后细胞上清液中IL-8的浓度；Western blot方法分析TNF-α刺激MHCC-97H细胞后p38MAPK; ERK和Akt通路磷酸化蛋白表达,免疫荧光方法分析了磷酸化p38 MAPK, ERK和Akt蛋白在细胞内的表达和分布；用通过免疫荧光和非放射性NF-κB p50/p65转录因子活性试剂盒检测了核蛋白中NF-κB p65的含量；用MTT比色法检测了TNF-α及其它信号通路抑制剂对MHCC-97H增殖的影响。研究结果1. MHCC-97H在无TNF-α干预的情况下分泌少量的IL-8, TNF-α刺激后可以明显促进MHCC-97H细胞分泌大量的IL-8,并随着时间的延长而增加(p<0.05)。IL-8的生成与TNF-α的浓度相关,不同浓度组之间有显著的统计学差异(p<0.01)。2. TNF-α、SB203580(p38 MAPK通路抑制剂)、PD98059(ERK通路抑制剂)、LY294002和Wortmannin(均为PI3K通路抑制剂)均可显著抑制细胞的增殖(p<0.05)。3. Western blot:TNF-α刺激MHCC-97H细胞后可上调p38 MAPK、ERK和PI3K/Akt磷酸化水平,其中p38通路最为显著。4.免疫荧光：与对照组相比,MHCC-97H经TNF-α干预1h后,p38 MAPK、ERK和Akt磷酸化蛋白明显增加,细胞浆和细胞核内均有分布,与western blot结果一致。5.研究不同信号通路对TNF-α诱导MHCC-9H分泌IL-8的实验结果显示,与对照组(仅用TNF-α干预组)相比,SB203580、PD98059、LY294002和Wortmannin可以显著抑制TNF-α诱导的IL-8分泌(p<0.05),且具有浓度依赖性。6. TNF-α对NF-κB通路的影响。TNF-α可以显著促进NF-κB p65蛋白的核转位,并且具有浓度依赖性(p<0.05)。免疫荧光结果：对照组中NF-κB p65主要分布在细胞浆中,TNF-α干预后,细胞核内NF-κB p65明显增多。7. p38 MAPK通路抑制剂(SB203580)对TNF-α诱导的NF-κB核转位的影响。与对照组相比,SB203580可以部分抑制NF-κB p65的核转位,且具有浓度依赖性(p<0.01)。8.CCR1、CCR2和CCR3信号通路对TNF-α诱导MHCC-9H分泌IL-8的影响。ELISA检测结果提示,UCB35625(CCR1抑制剂)和RS504393(CCR2抑制剂)对TNF-α诱导的IL-8分泌无影响,SB328437(CCR3抑制剂)可以抑制TNF-α诱导的IL-8分泌,不同浓度组间具有明显差异明显(p<0.05)。主要结论1.MHCC-97H细胞在无TNF-α干预的情况下分泌少量的IL-8, TNF-α显著增加MHCC-97H分泌IL-8。2. p38 MAPK、ERK和PI3K/Akt信号途径参与了TNF-α调节MHCC-97H细胞分泌IL-8; p38MAPK通路通过NF-κB信号途径调节IL-8的分泌。3. TNF-α诱导人肝癌细胞系MHCC-97H分泌IL-8与CCR3信号通路存在交叉对话。