研究背景肺癌是当今发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。依据临床和病理特征,可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC),二者中NSCLC占80.4%。由于大部分肺癌患者被诊断明确时已属于中、晚期,患者5年生存率往往低于10%。近年来,以含铂双药主的传统给药模式的疗效遭遇瓶颈,随着对NSCLC发病机制及其恶性生物学特征的深入研究,分子靶向治疗逐渐成为NSCLC治疗研究的焦点。以表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)为靶点的小分子酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)对于携带优势突变的患者中显示出较好的反应率,在晚期进展的NSCLC的治疗中独领风骚。其中,以吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)及埃可替尼(中国研发自主知识产权)为代表的EGFR-TKIs使NSCLC患者显著获益。然而随着EGFR-TKI治疗方案的临床推广,获得性耐药却不可避免接踵而至。研究证实,50%的肺腺癌患者经过EGFR-TKIs治疗有效6-12个月后出现获得性耐药,患者最终会出现病情进展或复发。因此,全面了解EGFR-TKIs耐药机制,探讨克服耐药的策略成为亟待完成的重要课题,以期为NSCLC的个体化、精准治疗提供有益参考。肿瘤干细胞(Cancer Stem cells,CSCs)是指存在于肿瘤组织中的具有干细胞性质的一小部分细胞群体。具有自我更新、分化潜能及高致瘤性和耐药性的特点。EGFR-TKIs耐药可能是一种克隆进化模式,肿瘤细胞发生遗传及表观遗传学上的改变(选择压力及自发突变影响),如产生的改变具有选择优势,就可产生对原肿瘤细胞克隆更具竞争力的新肿瘤细胞克隆。CSCs是形成不同分化程度肿瘤细胞和促使肿瘤不断生长的根源。是肿瘤发生、发展及化疗敏感性的决定性因素之一。因此,我们推断,TKIs在诱导NSCLC EGFR优势突变TKIs-敏感细胞对其产生继发性耐药的过程中,肿瘤干细胞CSCs的逐步富集可能在该过程中发挥重要作用。JMJD2(Jumonji domain-containing protein)组蛋白去甲基化酶,是一类分子中含有Jumonji结构域的蛋白家族,包括JMJD2A-JMJD2D。组蛋白去甲基化酶JMJD2C在染色体的结构修饰和基因表达调控中发挥着重要的作用。近年来,随着对其晶体学结构、作用机制和生理功能的研究取得的进展,JMJD2C被证实为神经干细胞、造血干细胞及胚胎干细胞等增殖分化的核心调控因子。尽管已发现JMJD2C参与肿瘤发生发展等多样化生物进程异常,但仍缺乏JMJD2C参与肿瘤干细胞(CSCs)表型和生物学行为调控的作用及机制研究。实验目的本部分研究旨在探索组蛋白去甲基化酶JMJD2C参与NSCLC CSCs干性维持及自我更新的重要调控作用及其机制;进一步证实EGFR TKIs药物富集ALDH1bri+CSCs细胞亚群中JMJD2C水平升高参与NSCLC EGFR TKIs获得性耐药;并观察JMJD2C小分子抑制剂JIB-04干预对耐药模型药物敏感性的影响。研究完善了NSCLC EGFR TKIs获得性耐药后续治疗中基础理论支持,为NSCLC TKIs获得性耐药的后续治疗提供全新给药模式选择。试验方法采用qRT-PCR技术及Western Blot法对NSCLC高活性乙醛脱氢酶亚型ALDHbri+细胞群和ALDHlow-细胞群的基因表达谱系进行比较分析;通过体内、外悬浮培养克隆球形成能力、自我更新能力、倍比稀释致瘤能力及鼠尾静脉注射肺部克隆形成实验,证实JMJD2C参与NSCLC ALDHbri+细胞干性维持及自我更新能力;采用Aldefluor试验及流式细胞术检测JMJD2C小分子抑制剂干预后细胞及小鼠残余瘤中ALDHbri+亚群百分比;采用qRT-PCR技术检测JMJD2C对一系列多潜能相关性干性核心转录因子表达调控;用吉非替尼采用逐步方法去诱导人肺腺癌细胞PC9形成耐药的细胞株,命名为PC9/GR;细胞的半数抑制浓度(IC50)以及细胞生长曲线用CCK-8法去检测,并根据公式计算耐药指数以及倍增时间;用倒置显微镜,去观察亲本株及耐药株形态学的改变;用流式细胞术分别检测两细胞株的细胞周期;用Aldefluor试验以及流式细胞术分别检测这两细胞株中ALDHbri+亚群的百分比;qRT-PCR及Western Blot法检测JMJD2C基因表达水平差异;用JIB-04干预耐药株PC9/GR后再用MTT法、平板克隆法及悬浮培养克隆成球法去检测其对吉非替尼敏感性的变化及机制;采用裸鼠皮下接种成瘤法进一步观察吉非替尼及JIB-04单独或联合作用于PC-9/GR后,各组异体移植瘤的缓解水平;采用免疫组织化学法检测EGFR TKIs敏感及获得性耐药NSCLC组织中JMJD2C及ALDH1表达差异及相关性。结果本研究第一部分旨在探讨组蛋白去甲基酶JMJD2C在NSCLC中的调控作用及可能机制。首先,对NSCLC高活性乙醛脱氢酶亚型ALDHbri+细胞群和ALDHlow-细胞群的基因表达谱系进行比较分析,证实,组蛋白去甲基酶JMJD2C在ALDHbri+细胞亚群中表达显著增高;其次,通过体内、外实验,证实JMJD2C参与NSCLC ALDHbri+细胞群的悬浮培养克隆球形成能力、自我更新能力、分化能力、ALDHbri+亚群百分比及致瘤能力的调控;进一步,我们证实,JMJD2C通过调节一系列多潜能相关性干性核心转录因子的转录活性及表达,从而参与调控NSCLC ALDHbri+CSCs表型、干性维持及自我更新等生物学行为。其中,c-Myc为降低最显著的干性转录因子。本研究第二部分旨在探索建立EGFR-TKIs获得性耐药人肺腺癌模型,并探讨其生物学特性及其耐药机制。我们研究证实,首先,PC-9/GR细胞株的耐药指数显著高于亲本株;细胞生长曲线显示,PC-9/GR细胞生长较亲代细胞慢,倍增时间延长;与亲本株相比,PC-9/GR耐药株的G0/G1期细胞增多,而S期细胞则明显下降;成功建系之后,我们对耐药株的分子表型及细胞亚群行进一步分析,发现PC-9/GR细胞中ALDH1bri+CSCs亚群比例及JMJD2C表达显著高于亲本株;进一步研究中,我们采用JIB-04,组蛋白去甲基化酶JMJD2C小分子抑制剂,有效的增加了EGFR TKIs-获得性耐药NSCLC细胞系PC-9/GR对吉非替尼的敏感性;联合给予吉非替尼和小分子抑制剂JIB-04比单药或对照组更有效促进EGFR-TKIs耐药的异体移植瘤小鼠的肿瘤缓解;这和JIB-04能够靶向NSCLC异体移植瘤中富含的高比例ALDH1bri+CSCs密切相关。组织标本中,我们证实TKIs获得性耐药的NSCLC组织中JMJD2C及ALDH1表达显著高于TKIs敏感NSCLC组织,且两者呈正相关。因此,我们证实,NSCLC PC9/GR细胞耐药性的产生与EGFR TKIs药物富集ALDH1bri+CSCs细胞亚群中JMJD2C水平升高有关。因此,协同或序贯给予吉非替尼和组蛋白去甲基化酶JMJD2C小分子抑制剂JIB-04治疗可能是EGFR TKIs耐药后NSCLC的一个全新给药模式选择。结论1.组蛋白去甲基化酶JMJD2C在NSCLC ALDHbri+表型的细胞亚群中表达显著高于ALDHlow-亚群,因此,推测JMJD2C在维持高ALDHbri+表型的NSCLC肿瘤干-样细胞(CSCs)发挥重要调控作用。2.JMJD2C参与NSCLC ALDHbri+CSCs细胞群的干性维持及自我更新。3.JMJD2C参与调控NSCLC一系列干性调控核心转录因子,从而参与多潜能干性维持。4.吉非替尼体外浓度递增诱导法可成功建立EGFR-TKIs耐药人肺腺癌PC9/GR细胞模型。5.NSCLC PC9/GR细胞耐药性的产生与EGFR TKIs药物富集ALDH1bri+CSCs细胞亚群中JMJD2C水平升高有关。6.组蛋白去甲基化酶JMJD2C小分子抑制剂JIB-04代表一种新型表观遗传抗癌药,在携带EGFR优势突变的NSCLC患者人群中,联合TKIs类药物,可延缓或攻克EGFR TKIs药物抵抗或耐药,为EGFR TKIs获得性耐药的后续治疗提供一些值得借鉴的基础理论支持。协同或序贯给予EGFR TKIs和组蛋白去甲基化酶抑制剂治疗可能是EGFR TKIs耐药后NSCLC的一个全新给药模式选择。