生物传感是基于生物分子识别及其下游信号转换，进行目标物检测的一类分析方法，是分析化学与生命科学的交叉研究领域。比较其它分析方法，它有着不少的优势，特别是提高了分析速度和应用灵活性。随着电子、微电子和机械系统的进步，便携式、集成式传感元件的开发，生物传感方法研究有机会为医疗、环境保护、食品安全乃至公共安全等领域提供更多现场快速检测技术，为公共健康与公共安全建立第一道防线。近年来，纳米材料领域的研究不断突破，核酸识别、核酸信号放大新技术的持续发展，为构建高灵敏、高选择性、快速高效的新型生物传感器提供了更完美的设计思路，为生物传感器实现不同分析靶标的现场快速检测提供了更有力的平台。本论文则基于当前热点纳米材料-安全环保的碳、硅纳米材料发展了三个颇具医学诊断应用前景的生物传感器，其中有细胞信号通路重要蛋白酶-磷脂酶D的检测，活细胞及亚细胞器的示踪。首次报道非氧化石墨烯通过非共价生物功能化应用于生物传感器，也是首次展示利用无毒纳米材料对细胞能量工厂-线粒体的示踪研究效果能够堪比有机染料。同时涉及其中的纳米材料-非氧化石墨烯、硅量子点、碳量子点的生物功能化研究都各自有小小突破，为它们在生物传感领域的进一步发展奠定了良好的基础。本论文还基于核酸杂交技术和金属离子介导的核酸伪杂交技术分别发展了针对生物体重要的癌症标记物-小RNA（microRNA）和环境污染物-汞离子的检测技术，并且对这两种靶标都实现了高灵敏高选择性的分析。所有研究具体内容如下所述：为了进一步拓宽非氧化石墨烯在生物传感领域的应用，在第2章中发展了一种新颖的双层磷脂膜修饰的非氧化石墨烯复合纳米材料，它是通过非氧化石墨烯大面积双面芳香环层和已合成的脂质体疏水烷烃夹层利用范德华力和疏水作用力形成的，并且这种非共价组装过程不会破坏石墨烯片层的电子大共轭结构，使得该复合纳米材料保留了非氧化石墨烯卓越的电学和光学性质，而表面修饰的磷脂膜层则能赋予非氧化石墨烯良好的生物相容性、亲水性以及表面可控修饰性，为石墨烯的生物功能化提供了一个新的实用平台，该复合纳米材料由磷脂双分子层和疏水的还原石墨烯片组成，类似细胞膜的结构，通过利用荧光素标记的磷脂掺杂在复合纳米材料中，发展出了一个检测磷脂酶D活性的荧光生物传感器。该生物传感器具有高灵敏和宽检测范围的特性，其检测下限低至0.010U/L，优于以往报道的磷脂酶D分析方法，而且基于该分析模式是一步均相法，该生物传感器有极好的适应性，操作简易性，以及进一步实现高通量分析和实时监测反应动力学的可能。近年来，硅纳米材料凭借它出色的光学、电学、力学性质，以及表面可控修饰，可适应硅材料作为半导体材料的特殊应用吸引科学家们的关注，尤其是零维硅纳米材料-硅量子点，基于硅材料本身无毒、化学惰性、生物相容性极好，非常适合生物传感方法研究，特别是生物成像领域。在第3章中我们首先将电化学刻蚀法合成的硅点用双氧水氧化钝化，再用硅烷化试剂在有机相中进一步老化，转入水相后通过碳二亚胺/硫代琥珀酰亚胺法（EDC/Sulfo-NHS）进行表面水溶性改性获得最终的硅量子点，该硅量子点具有优良的水分散性，强荧光性（量子产率30%），合适的尺寸（约4nm），非常适合作为荧光成像探针。此方法合成的硅点表面保留了一定数目的伯胺基团，可以被进一步功能化。研究中我们分别选用线粒体定位试剂三苯基膦和溶酶体定位试剂吗啉通过EDC/Sulfo-NHS交联法进行功能化，并通过双光子荧光共聚焦成像证明其示踪效果，实验结果证明，通过和商品化的有机染料对比，硅量子点能准确、快速（约15min）对亚细胞器线粒体和溶酶体进行定位，且成像效果不逊于有机染料探针，此外线粒体会在细胞凋亡初期肿胀变圆，通过诱导剂引发细胞开始凋亡，实时成像图显示了我们合成的功能化硅量子点能很好的表现出线粒体形状变化，进行细胞早期凋亡的示踪，表明所得的硅量子点是有潜质的生物成像探针。不光是石墨烯，碳纳米材料本身优异的光学、电学性质和无毒、化学惰性、容易代谢等特性促使科学家们不断开发其在生物、医学领域的应用。为了拓宽荧光碳纳米材料在生物成像领域的发展空间，在第4章中我们合成了一个双层脂质体共价修饰的新型碳量子点，因为传统一步法合成出的碳点往往光学性质差强人意（量子产率通常低于3%），很多相关研究都着力于表面改性提高量子产率，例如通过氨基修饰的低聚PEG（分子量约1500）进行表面钝化处理，实现光学性能提高（量子产率约10%），而我们则尝试用相似分子量的磷脂代替氨基修饰的低聚PEG对碳点进行表面钝化，首先通过传统的硝酸回流法合成出碳点前体，再通过超滤装置筛选出所需颗粒大小（小于10nm），同时合成好双分子层脂质体。利用碳二亚胺/硫代琥珀酰亚胺法将二棕榈酰磷脂酰乙醇胺的氨基末端和碳点表面因氧化产生的羧基官能团交联获得最终的碳量子点，该碳点荧光强度比同浓度的前体碳点高3倍，尺寸约5nm，表面包裹的脂质体双分子层能赋予碳点优异的生物相容性和表面可控修饰性。我们进一步探索了碳点在HeLa（宫颈癌）细胞中的双光子荧光共聚焦成像效果，实验证明碳点在细胞各个位置都有分布，说明该方法合成的碳点非常适合生物成像领域的应用。汞是高毒的环境污染物，尤其是其具有高迁移性、持久性、甲基化作用性、生物富集性及食物链放大性等特点，即便是极微量的存在于环境中，对动植物及人类的健康也是极大的威胁。在第5章中我们设计了一个非常新颖的，基于T-Hg2+-T配位化学原理，能高灵敏性、高选择性的检测Hg2+的电化学传感器。这项技术的设计思路是邻近的聚T DNA链之间在Hg2+介导条件下产生的协同效应。先是在金电极表面，通过Au-S共价键，有序地组装上一层由8个碱基组成的全TDNA单链探针，且该探针末端标记了电活性物质二茂铁，当没有Hg2+存在时，电极表面的聚T DNA单链探针都各自柔软地趴在金盘表面，二茂铁离金表面很近，电子发生传递，可检测到二茂铁的氧化还原电流；当Hg2+存在条件下，最相邻的聚T DNA单链探针可以成对协同性地结合Hg2+，即电极表面的探针构象在Hg2+介导的T-T错配情况下可由柔软的单链结构变成相对刚性的类似双链的结构，这个构象变换导致了二茂铁远离电极表面，电子传递受阻，检测到的氧化还原电流大大减弱。通过电化学信号的变化可以判断Hg2+的存在及定量分析。这个检测机理已经得到毛细管电泳及一系列电化学方法的充分验证，并且实验结果表明这个传感器能在1nM-2μM之间高灵敏检测Hg2+，检测下限能到达0.5nM，优于本文中介绍的其它检测方法，并且这项技术表现出了优异的选择性，这是和传统的电化学方法（阳极溶出分析法ASV）检测Hg2+最大的区别，而且这个Hg2+传感器所需试剂非常少、操作步骤很简单又有着极好的再生性。如此经济高效的电化学传感器在实时现场监测环境中Hg2+将有很好的应用前景。MicroRNA（miRNA）在生物体内发挥着至关重要的调控功能，不仅对细胞的生长、分化和凋亡有着重要的影响，而且还与许多疾病有着密切的关系，研究者发现在白血病、结肠直肠癌、乳腺癌和心血管障碍等疾病中，相关的miRNA都异常表达。由于miRNA具有核酸序列短、含量少以及相互之间序列相似性等特点，分析测试有一定的挑战性。传统的检测方法有印记杂交技术、微阵列检测技术、基于RCA信号放大的检测技术、阳离子聚合物等。本论文第6章中将向大家报道一种基于双重侵入式信号放大技术（Invader assay）高灵敏高选择性检测miRNA的方法。曾有研究小组基于侵入式信号放大技术检测miRNA，但是都是将目标miRNA作为模板探针，对相似序列的miRNA不能实现很好的区分，我们则是将miRNA设计成第一重循环放大的侵入式探针，并且miRNA的存在不会立即形成侵入位点重叠结构，我们借鉴缺口连接PCR的原理，设计出miRNA的3’端距侵入位点数个核苷酸距离。当加入嗜热性Taq聚合酶，和相应的核苷三磷酸，完全匹配的miRNA成为引物开始从3’端开始聚合延伸，当聚合延伸到达信号探针和模板探针杂交区的第一对核苷酸（即侵入位点），将距信号探针侵入位点核苷酸和后一位（靠近3’端）的核苷酸之间磷酸骨架断开，信号探针5’翘起一段离开，另一段也因杂交序列变短，与模板杂交稳定性减弱并脱离模板，遂成为第二重循环放大的引物探针。第二重循环放大类似第一重循环，也是需要借助聚合的作用才能形成侵入式结构，进一步消弱了非特异性切刻作用，第二重循环的信号探针是5’标记荧光团荧光素，中间标记淬灭基团的Taqman探针，但侵入式结构形成，信号探针5’翘起并带有荧光素修饰的“翼”离开，和信号探针中间标记的淬灭基团分开，荧光信号增强，并且与靶序列miRNA的浓度成正比。实验结果证明，该方法可以一步实现两重循环放大，检测灵敏度高，下限可达10fmol/L，尤其是能区分相似的miRNA序列，实现了难得的miRNA选择性检测。