运动神经元变性是多种神经系统疾病的重要病理过程,由于运动神经元的不可再生性,严重的运动神经元损伤造成的运动功能丧失带来永久的痛苦和家庭负担。运动神经元损伤有急性损伤和慢性损伤两种。脊髓损伤(SCI)是急性损伤的代表性疾病,运动神经元疾病尤其是肌萎缩侧索硬化(ALS)则以慢性进行性运动神经元变性为主要病理特点。急性创伤性脊髓损伤的病理过程包括两方面:一是最初的机械损伤,二是创伤后继发的迟发性损害。包括血管的异常、缺血再灌注、谷氨酸兴奋毒、氧化应激和炎症反应等。肌萎缩侧索硬化(ALS)的病因推测有以下几方面:1)遗传环境因素。2)谷氨酸兴奋毒作用。3)氧化应激。4)免疫因素。5)营养因子失衡。但何为ALS发病的启动因素尚不明确。纵观运动神经元急、慢性变性的病理过程,我们看到,尽管不同疾病造成的运动神经元损伤的直接致病因素不同,但谷氨酸的兴奋毒作用和氧化应激的作用都不容忽视。对运动神经元急、慢性变性的体外研究主要应用运动神经元单细胞培养(包括纯化的原代运动神经元培养、运动神经元样的细胞株(NSC34)培养)、器官型脊髓、脑薄片培养模型。对运动神经元急、慢性变性的在体研究,不同的损伤因素造成不同的动物模型,压迫、轴索断伤等都能在动物体内模拟急性运动神经元变性。因为携带突变的人的SOD1(hmSOD1)基因的G93A鼠运动行为及病理变化与人类ALS极为相似,所以针对运动神经元慢性变性的研究主要聚焦在G93A转基因小鼠模型上。对运动神经元损伤的研究最根本的目的是能阻止其变性的过程,最大可能地保存运动功能。然而因为运动神经元在体内的不可代替性和不可再生性,使对运动神经元的研究步履维艰。本论文共分七部分:第一部分,建立大鼠脊髓薄片的培养方法,判断SMI-32对体内、外运动神经元标记的特异性。第二部分,寻找由切割造成的脊髓运动神经元丢失的原因,应用二相酶诱导剂干预,观察其有无保护作用并探讨机制。第三部分利用脊髓片的器官培养技术,用谷氨酸转运体抑制剂苏-羟天冬氨酸(THA)制作选择型脊髓前角运动神经元损伤的器官型培养模型,应用二相酶诱导剂干预,观察其有无保护作用并探讨机制。第四部分,根据谷氨酸的兴奋毒机制,利用谷氨酸转运体抑制剂苏-羟天冬氨酸(THA)制作运动皮层大锥体细胞损伤的脑片培养模型,应用二相酶诱导剂干预,观察其有无保护作用并探讨机制。第五部分,根据谷氨酸的兴奋毒机制,利用谷氨酸转运体抑制剂苏-羟天冬氨酸(THA)制作运动皮层大锥体细胞和脊髓运动神经元损伤模型,应用头孢曲松(Cef)干预,观察其有无保护作用。第六部分,根据谷氨酸的兴奋毒机制,利用谷氨酸转运体抑制剂苏-羟天冬氨酸(THA)制作运动皮层大锥体细胞和脊髓运动神经元损伤模型,应用胰岛素样生长因子(IGF-1)干预,观察其有无保护作用。第七部分,对引进的G93A转基因小鼠进行饲养、繁殖、鉴定和行为学评测。通过以上实验,我们试图揭示急、慢性运动神经元变性的一些相关因素,探讨谷氨酸兴奋毒作用和氧化应激在运动神经元损伤中的作用和相互影响,观察二相酶诱导剂和其它化合物对运动神经元损伤的保护作用并深入阐明其作用机制。并对引进的G93A转基因小鼠饲养、繁殖、鉴定和行为学评测,为今后对慢性进行性运动神经元变性疾病—ALS的治疗研究做好铺垫。第一部分脊髓运动神经元的生长发育及器官型体外培养模型的建立目的:建立了能在体外长期存活的稳定的脊髓器官型培养模型,判断SMI-32作为运动神经元标记物的特异性和灵敏性。方法:取生后1天、7天、1月龄、2月龄的SD鼠,切取腰膨大浸入4%多聚甲醛固定24小时。震荡切片机切片,片厚30μm。置于0.1M PB中漂洗后进行免疫组织化学染色。取出生后7天乳鼠的腰段脊髓组织切片做脊髓器官型培养,培养第三天更换培养液一次,取培养1天、7天、1月的脊髓片用SMI-32进行免疫组化染色,对脊髓前角运动神经元进行记数。结果:用SMI-32能够标记不同月龄SD大鼠腰膨大脊髓运动神经元,我们发现尽管由于发育阶段的不同SMI-32阳性运动神经元以及突起、纤维的分布有所改变,但不同月龄SD大鼠腰膨大脊髓运动神经元都可以用SMI-32标记。体外培养的脊髓薄片的运动神经元也可以用SMI-32标记,由于切割等因素会造成培养一周内运动神经元的数量下降,但一周后乃至培养四周运动神经元数量和形态相对稳定,是进行实验干预的最佳时间。结论:脊髓薄片的体外培养技术是研究运动神经元病理生理机制尤其是慢性损伤的理想模型。SMI-32是标记运动神经元的理想Marker。第二部分二相酶诱导剂对创伤导致的脊髓运动神经元损伤的保护作用目的:探讨二相酶诱导剂能否对创伤引起的脊髓运动神经元损伤有保护作用。方法:取出生后7天乳鼠的腰段脊髓组织切片做脊髓器官型培养,在培养液中分别加入二相酶诱导剂t-BHQ, D3T, CPDT(溶于0.1%的DMSO中,30μmol/L),溶剂对照组加入0.1%的DMSO,正常对照组培养液中不加任何药物,培养第三天更换培养液一次,培养7天后,用运动神经元的标记物SMI-32进行免疫组化染色,对脊髓前角运动神经元进行记数,各组留取培养两天的培养液检测谷氨酸的变化。各组留取培养两天脊髓片进行电镜观察和Nrf2和HO-1mRNA的检测。结果:在体外培养的脊髓片中观察到运动神经元由于切割造成的损伤数目会有所减少,经过一周的修复,运动神经元的数目趋于稳定,培养四周与培养一周运动神经元的数目没有明显的改变。在此基础上,我们检测了培养液中谷氨酸水平,发现新鲜配制的正常培养液的谷氨酸浓度是17μmol/L,脊髓片培养48小时后脊髓片的培养液的谷氨酸浓度明显升高,培养一周后下降。在电镜下观察到切割后造成运动神经元变性坏死,线粒体嵴断裂、肿胀等现象。在脊髓片培养液中加入二相酶诱导剂:t-BHQ, D3T, CPDT,我们发现运动神经元存活数目明显增加,电镜下,运动神经元线粒体损害明显减轻。进一步通过RT-PCR检测发现Nrf2和HO-1mRNA表达明显升高。结论:通过以上实验,我们认为,脊髓片体外培养最初一周的运动神经元减少主要是由于切割造成的,这一修复过程类似于严重的脊髓外伤。谷氨酸升高造成的兴奋毒作用和线粒体损害参与了外伤性运动神经元损伤的病理过程。而二相酶诱导剂通过激活Nrf2和血红素加氧酶1(HO-1),能够提高了脊髓薄片的抗氧化能力,降低了脊髓运动神经元线粒体损害的程度,增加了运动神经元的存活。第三部分二相酶诱导剂对谷氨酸转运体抑制剂(THA)诱导的脊髓运动神经元损伤的保护作用目的:研究二相酶诱导剂—t-BHQ(Tert-butylhydroguinone), D3T(3H-1,2-dithiole-3-thione), CPDT对THA诱导的慢性运动神经元变性的保护作用。方法:选用生后7天的SD乳鼠腰段脊髓组织切成薄片进行体外培养,正常培养一周后,二相酶诱导剂组在培养液中分别加入t-BHQ, D3T, CPDT(浓度为15、30μmol/L,用DMSO溶解,DMSO在培养液中的终浓度为0.1%)。THA组加入100μmol/L的THA,溶剂对照组在培养液中加入DMSO,终浓度为0.1%。正常对照组培养液中不加任何药物。4周后应用免疫组织化学方法显示运动神经元数量变化并在电镜下观察其超微结构的变化,并对Nrf2/HO-1的mRNA、蛋白、及酶活性进行了检测,同时检测了培养液中谷氨酸的浓度和谷氨酸转运体—GLT1的表达改变,深入探讨二相酶诱导剂的作用机制。结果:谷氨酸转运体抑制剂(THA)能够造成选择性运动神经元损伤,二相酶诱导剂对THA引起的运动神经元的丢失有保护作用,且能够减轻THA引起运动神经元超微结构尤其是线粒体损害。并进一步证实THA由于抑制了谷氨酸的转运导致胞外谷氨酸增加,引起谷氨酸兴奋毒作用,造成运动神经元死亡。CPDT对细胞外谷氨酸水平没有影响,也不影响GLT1的表达,而是通过激活Nrf2/HO-1信号通路提高了脊髓的抗氧化能力,减少了运动神经元的丢失。结论:应用谷氨酸转运体抑制剂(THA)造成细胞外谷氨酸增高,引起谷氨酸兴奋毒造成运动神经元的丢失。二相酶诱导剂虽然不能影响谷氨酸的转运,但能通过激活Nrf2/HO-1信号通路提高了脊髓的抗氧化能力,减少了运动神经元的丢失,二相酶诱导剂有望成为ALS治疗的新切入点。第四部分二相酶诱导剂CPDT对谷氨酸转运体抑制剂(THA)诱导的运动皮层大锥体细胞损伤的保护作用目的:研究二相酶诱导剂—CPDT对THA诱导的皮层锥体细胞损伤的保护作用。方法:选用1日龄SD大鼠将其包含运动皮层的脑组织切成薄片进行体外培养,正常培养两周后,二相酶诱导剂组在培养液中加入CPDT(浓度为15、30μmol/L,用DMSO溶解,DMSO在培养液中的终浓度为0.1%)。溶剂对照组在培养液中加入DMSO,终浓度为0.1%。THA组加入100μmol/L的THA,正常对照组培养液中不加任何药物。药物干预3周后应用免疫组织化学方法显示运动神经元数量变化,并对Nrf2/HO-1蛋白进行了检测,深入探讨二相酶诱导剂的作用机制。结果:谷氨酸转运体抑制剂(THA)能够造成慢性皮层锥体细胞损伤,二相酶诱导剂对THA引起的皮层锥体细胞的丢失有保护作用。并进一步证实CPDT是通过激活Nrf2/HO-1信号通路提高了皮层的抗氧化能力,减少了皮层锥体细胞的丢失。结论:本实验研究成功地建立了运动区脑片的培养方法,应用谷氨酸转运体抑制剂苏-羟天冬氨酸(THA)引起皮层运动神经元数目的减少。证实二相酶诱导剂通过激活Nrf2/HO-1信号通路对THA引起的皮层运动神经元的丢失发挥保护作用。第五部分头孢曲松对THA诱导的大鼠运动神经元损伤的保护作用目的:研究β内酰胺类抗生素-头孢曲松对THA诱导的运动神经元损伤的保护作用。方法:选用生后7天的SD大鼠和1日龄SD大鼠,7日龄大鼠用于脊髓片培养,1日龄大鼠用于脑片培养。在无菌的条件下断头取脊髓腰膨大部分和脑组织,将脊髓腰膨大部分和包含运动皮层的脑组织切成薄片进行体外培养2周后进行干预,对照组加入正常培养基,模型组给予谷氨酸转运体抑制剂-THA(100μmol/L)进行干预,头孢曲松组于培养液中同时加入THA和头孢曲松(100μmol/L)。药物干预3周后,应用免疫组织化学方法显示运动神经元,计数其数量变化。结果:THA能够诱导脊髓前角运动神经元和皮层运动神经元死亡,头孢曲松能够提高运动神经元的存活数量。结论:头孢曲松对THA诱导的运动神经元损伤具有保护作用,β内酰胺类抗生素有益于ALS的治疗。第六部分胰岛素样生长因子(IGF-1)对THA诱导的大鼠运动神经元损伤的保护作用目的:研究胰岛素样生长因子(IGF-1)对THA诱导的运动神经元损伤的保护作用。方法:选用生后7天的SD大鼠和1日龄SD大鼠,7日龄大鼠用于脊髓片培养,1日龄大鼠用于脑片培养。在无菌的条件下断头取脊髓腰膨大部分和脑组织,将脊髓腰膨大部分和包含运动皮层的脑组织切成薄片进行体外培养,对照组加入正常培养基,模型组给予谷氨酸转运体抑制剂-THA进行干预,IGF-1组于培养液中同时加入THA和不同浓度的IGF-1。药物干预3周后,应用免疫组织化学方法显示运动神经元,计数其数量变化。结果:THA能够诱导脊髓前角运动神经元和皮层运动神经元死亡,IGF-1能提高运动神经元的存活。结论: IGF-1对THA诱导的慢性运动神经元损伤具有保护作用,IGF-1有益于ALS的治疗。第七部分SOD1基因突变对运动神经元的影响目的:将由Jackson Lab引进的B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J鼠和用于繁殖hmSOD1(G93A)基因阳性的半合子(hemizygote)鼠进行鉴定、繁殖和观察。为ALS的实验研究的深入进行奠定基础。方法:将B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J鼠和hmSOD1(G93A)基因阳性的半合子(hemizygote)鼠交配,留取子代鼠的鼠尾和血液,提取组织和血液DNA进行PCR反应以鉴定携带hmSOD1的阳性鼠。并对子代鼠进行行为学观察。结果:所有存活的子代鼠发育情况良好,活动力强。hmSOD1基因阳性鼠在15周左右逐渐有行动缓慢伴肢体震颤,伸展困难。随后出现一侧后肢行走时的拖拽现象和萎缩,另一侧后肢也继之受累,整个后肢和后半身逐渐萎缩消瘦,双侧后肢呈伸直样,终末期的转基因鼠因进食困难而衰竭死亡,存活时间约19-20周。hmSOD1基因阴性鼠无上述表现,生命周期与其他正常小鼠一样。应用PCR进行测序,阳性率高,特异性强。测序结果通过PubMed的BlAST检验证实PCR产物来自于hSOD1基因,并存在G93A(在基因上表现为的GCT替代GGT)突变。结论:G93A SOD1转基因小鼠的成功构建,给人类肌萎缩侧索硬化症的深层次研究和治疗策略的摸索提供了几乎全真的疾病模型,本实验通过对G93A SOD1转基因小鼠的引进、鉴定、繁殖和观察,成功的建立了子代鼠的繁育和转基因阳性鼠基因鉴定和行为学观察方法,证实了SOD1基因突变的确造成了运动神经元损伤。为今后研究的深入奠定了实验基础。第八部分脊髓和肌肉共培养方法的建立目的:建立能在体外长期存活的稳定的脊髓和肌肉共培养的器官型培养模型。方法:脊髓和肌肉共培养时,将7日龄SD乳鼠快速在75%乙醇、碘酒、75%乙醇中浸泡消毒,断头,在无菌条件下快速分离、取出整条脊髓,解剖显微镜下分离并剪断腰段脊髓的神经根,用McIIwain组织切片机切成350μm厚的薄片,将腰段脊髓的切片转移到GBSS中。在缓冲液中分辨脊髓的前角和后角,将前角前索的纤维剪除。肌肉组织取自同一只鼠的后肢。沿肌纤维的方向撕成条。将肌肉和脊髓种植在同一个insert中。脊髓单独培养和共培养每组9片,培养4周后取出,4%多聚甲醛固定40分钟后进行免疫组化染色,戊二醛固定备电镜观察。运动神经元用SMI-32进行免疫组化染色,对脊髓前角运动神经元进行记数。结果:共培养的脊髓片上运动神经元数量较脊髓片单独培养多,有显著性差异。用罗丹明-α-金环蛇毒素和乙酰胆碱酯酶两种方法标记神经肌肉接头,在共培养的肌肉上观察到了和在体相似的运动终板,呈棕色或红色荧光,卵圆形。电镜观察体外培养的肌细胞多核,细胞器正常。共培养的标本中,发现有神经深入到肌细胞间。在突触囊泡中可以看到清亮的和致密的递质小泡。结论:本实验对体外培养的器官型脊髓薄片和肌肉共培养,发现二者能够在体外建立联系,而且肌肉组织能够提供脊髓营养成分,提高运动神经元的存活。本实验为进一步研究运动神经元和肌肉之间的相互影响和相互作用提供了一个稳定的体外模型。