异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cells transplantation；allo-HSCT)是目前用于治疗良、恶性血液病、联合免疫缺陷病和某些自身免疫性疾病及一些实体肿瘤等疾病的重要手段。急性移植物抗宿主病（acutegraft-versus-host disease；aGVHD）是影响异基因造血干细胞移植成功最常见的并发症，其病理生理机制为植入的供体免疫活性细胞（T淋巴细胞）被宿主（受体）抗原致敏而激活、增殖、分化，直接或间接导致靶器官的损害。aGVHD往往伴有造血功能障碍，影响患者生存。但目前aGVHD导致免疫造血功能障碍的机制尚不清楚。其机制有两种可能：一是aGVHD过程中产生的细胞因子导致造血功能受抑，另一可能机制为骨髓微环境（niche）缺陷导致的HSC功能调控障碍。近年来的研究表明疾病状态下骨髓niche对HSC有显著影响。目前研究认为骨髓niche主要有两种，即骨内膜niche和血管niche，前者主要由位于骨内膜的成骨细胞所组成，后者主要由血管窦状隙内皮细胞（sinusoidal endothelial cells；SEC）和血管周围细胞组成。研究发现血管niche在维持HSC池稳定和调控HSC自我更新能力等方面发挥重要作用。allo-HSCT后受体造血细胞来源于供体造血干细胞，而骨髓niche仍为受体来源，因此理论上受体骨髓niche，尤其是血管niche可为急性GVHD的靶器官。由此，我们设想急性GVHD导致骨髓niche尤其是血管niche功能缺陷，从而影响niche对供体正常HSC的功能调控，引起HSC生物功能改变和数量减少。因此研究急性GVHD是否通过导致骨髓血管niche功能缺陷从而引起造血功能障碍和初步阐明其机制，具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。本研究拟解决以下几个主要问题：1.如何鉴定小鼠骨髓窦内皮细胞？建立主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex；MHC）半相合小鼠骨髓移植aGVHD模型，利用多参数设门，流式细胞术分选骨髓窦内皮细胞，并用细胞化学染色等手段鉴定。2.aGVHD对骨髓窦内皮细胞的影响及其机制如何？采用流式细胞术和骨髓组织病理学、RT-PCR方法检测aGVHD组及对照组（无aGVHD）小鼠骨髓窦内皮细胞的数量、比例、增殖、凋亡及MHC分子表达及T细胞亚群的变化及FasL表达情况。3. aGVHD状态下HSCs生物学特性变化与骨髓内皮细胞变化的相关性及机制？流式细胞术检测HSC的数量和比例；竞争性及连续性移植模型检测aGVHD对HSC、骨髓微环境的影响；流式细胞术检测骨髓干细胞趋化因子CXCR4及骨髓内皮细胞表达SDF-1表达情况（SDF-1/CXCR4轴）；RT-PCR方法检测HSC中C-Kit及骨髓窦内皮细胞SCF的基因表达强度（SCF/C-Kit轴）。第一部分小鼠半相合aGVHD移植模型建立和骨髓窦内皮细胞免疫表型及鉴定研究方法小鼠半相合aGVHD移植模型的建立：移植受体小鼠：雌性Balb/c(H-2d；表型CD45.2)；供体小鼠：雄性CB6F1(BALB/c H-2d；表型CD45.2×C57BL/6H-2b；表型CD45.1；F1H-2b/d；表型CD45.1/2)。随机分为三组： GVHD组每只受体小鼠移植CB6F1来源的骨髓细胞5×106和脾细胞6×107，正常移植对照组每只小鼠仅移植CB6F1来源的骨髓细胞5×106，空白对照组仅接受输注同体积的PBS。半相合移植模型受体小鼠移植前接受8Gy同位素铯照射。观察移植后急性GVHD发生情况及小鼠生存、检测外周血。取移植后14、21天GVHD及BMT组小鼠皮肤、肝脏、小肠行常规石蜡包埋病理切片，HE染色。流式细胞检测造血细胞CD45.1、CD45.2表达了解植入情况。流式细胞术检测CD150+/CD48-设门检测造血干细胞数量比例骨髓窦内皮细胞免疫表型及鉴定流式细胞术检测正常小鼠骨髓单个核细胞Sca-1、CD45、VEGFR2、VEGFR3表达；SSClow/VEGFR设门分选细胞行VE-cadherin细胞化学染色，荧光显微镜观察阳性率，以分选CD4-/CD8+T细胞作为细胞化学染色对照。结果成功建立小鼠半相合移植急性移植物抗宿主病模型PBS组移植10天后出现死亡，急性GVHD组小鼠10天后逐渐出现腹泻、血便、体重减轻、脱毛、弓背等表现，15天后出现死亡，BMT组全部存活。急性GVHD的发病率为100%；病理切片HE染色提示：可见皮肤、肝脏、小肠组织形态学改变及其中不同程度炎性细胞浸润符合GVHD表现；流式细胞检测提示受鼠造血细胞表型由CD45.2阳性转变为CD45.1/2阳性（单纯CD45.2表达低于1%）。外周血和造血干细胞的数量比例减少提示该模型可出现造血抑制，能够满足研究的需要。小鼠骨髓窦内皮细胞免疫表型表现为Sca-1-、CD45-、VEGFR2+、VEGFR3+、VE-cadherin+， SSClow/VEGFR3+的窦内皮细胞高表达VEGFR2，低表达CD45；流式细胞术SSClow/VEGFR3+设门分选窦内皮细胞喷涂于玻片行VE-cadherin细胞化学染色，阳性率95%以上。CD8+T细胞作为对照，荧光显微镜下结果阴性。小结以上研究结果表明急性GVHD小鼠模型建立方法可行并适用于对GVHD条件下HSCs功能影响的研究；VEGFR3是骨髓窦内皮细胞较为特异的指标，流式细胞术SSClow/VEGFR3设门可以用于进一步研究骨髓窦内皮细胞。第二部分急性GVHD小鼠骨髓血管niche缺陷对HSC/HPC的影响研究方法二次移植检测移植后小鼠造血干细胞的增殖分化能力连续移植：GVHD和BMT组移植后14天受体小鼠（供鼠为CB6F1：H-2b/d；表型CD45.1/2，受鼠为Balb/C：H-2d；表型CD45.2）处死后，收集胫骨MNC，以细胞数5×106/只进行二次移植，受体小鼠为Balb/C小鼠，移植前均经8Gy照射；二次移植后14天流式检测骨髓单个核数量及粒系（Gr-1）、单核（CD11b）、B细胞（B220）阳性细胞的比例。竞争性移植：移植后14天GVHD和BMT组小鼠（供鼠为CB6F1：表型CD45.1/2，受鼠为Balb/C：表型CD45.2），PBS冲洗获得下肢骨MNC，以移植后小鼠MNC细胞与正常F1小鼠（CB6F1：表型CD45.2）MNC细胞等量混合，细胞数5×106/只植入8Gy放疗后的Balb/C受鼠，二次移植后14天检测两组小鼠CD45.1+/CD45.2+造血细胞中粒系（Gr-1）、单核（CD11b）、B细胞（B220）阳性细胞比例。流式细胞术检测小鼠骨髓中造血干细胞比例：取移植后第14、21天GVHD组及BMT组小鼠，Lin-/CD48-/CD150+标记造血干细胞，检测干细胞占MNC细胞比例。流式细胞术检测小鼠骨髓造血干细胞CXCR4及骨髓内皮细胞SDF-1的表达（SDF-1/CXCR4轴）：PBS冲洗获得移植后14天GVHD及BMT组小鼠骨髓MNC，检测Lin-/CD48-/CD150+标记的造血干细胞检测CXCR4的表达比例，检测SSClow/VEGFR3+内皮细胞中SDF-1的表达比例，比较两组差异。RT-PCR方法检测小鼠骨髓内皮细胞SCF及造血干细胞C-kit相关基因的表达（SCF/C-kit轴）：取移植后第14天GVHD及BMT组小鼠各3组，常规获取骨髓单个核细胞，VEGFR2+/VEGFR3+/Sca-1-设门分选骨髓窦内皮细胞，数量为5-8×105，Lin-/CD48-/CD150+设门分选造血干细胞，数量为5-7×105，Trizol吹打裂解后冻存于-40℃冰箱，定制相关引物后检测。结果二次移植：连续移植14天后GVHD与BMT组小鼠每个胫骨的MNC及粒系（Gr-1）、单核（CD11b）、B细胞（B220）的比例及绝对值均无差异（P均>0.05）；竞争移植14天后单个胫骨MNC及CD45.1+/CD45.2+绝对值及比例均无差异，竞争移植各系比例及绝对值均无差异（P均>0.05）。流式细胞术检测GVHD组移植后第14天造血干细胞比例低于BMT组：GVHD组Lin-/CD48-/CD150+占骨髓MNC细胞比例为(0.6175±0.033)%，BMT组比例为（0.745±0.015)%（N=4P=0.013）。移植后第14天GVHD组与BMT组造血干细胞表达CXCR4比例无差异：两组Lin-/CD48-/CD150+均高表达CXCR4，GVHD组比例为(96.5±7.65)%，BMT组比例为（94.8±6.42）%（N=4P>0.05）。移植后第14天GVHD组与BMT组骨髓窦内皮细胞表达SDF-1比例无差异：GVHD组比例为(93.7±8.53)%，BMT组比例为(87.5±10.61)%（N=4，P>0.05）。RT-PCR方法检测GVHD组移植后第14天小鼠骨髓窦内皮细胞SCF表达低于BMT组：GVHD组相对表达量均数为：0.0326±0.004(N=3)，BMT组相对表达量均数为：0.3285±0.079(N=3)。RT-PCR方法检测GVHD组移植后第14天小鼠骨髓造血干细胞C-Kit表达低于BMT组：GVHD组相对表达量均数为：0.0205±0.002(N=3)，BMT组相对表达量均数为：0.0341±0.003(N=3)。小结以上实验证明：发生GVHD的小鼠骨髓细胞中造血干细胞比例低于BMT组，但连续移植及竞争性移植证明来源于GVHD的小鼠的造血干细胞本身增殖分化能力并不低于BMT组，其抑制干细胞的原因来源于骨髓niche，GVHD条件下内皮细胞并不通过SDF-1/CXCR4轴影响干细胞的比例，GVHD小鼠骨髓内皮细胞SCF表达低于BMT组，受损的骨髓内皮破坏了造血干细胞的微环境，可能通过SCF/C-Kit途径影响干细胞的增殖。第三部分急性GVHD小鼠骨髓窦内皮细胞的变化与供者T细胞的关系研究方法流式细胞术检测小鼠骨髓窦内皮细胞数量、比例、增殖及MHC分子及Fas表达：PBS反复冲洗小鼠急性GVHD及BMT组移植后第14、21天单个胫骨，收集单个核细胞，光镜下计数，裂解红细胞后行流式细胞检测小鼠骨髓窦内皮细胞比例、数量：检测VEGFR2+/VEGFR3+/Sca-1-比例，结合MNC计算窦内皮细胞绝对值； SSClow/VEGFR3+/ki-67+细胞比例检测内皮细胞增殖；SSClow/VEGFR3+/Annexin V+/PI-检测内皮细胞凋亡；SSClow/VEGFR3+/Fas+检测骨髓窦内皮细胞的Fas表达强度； SSClow/VEGFR3+/MHC-Ⅰ、SSClow/VEGFR3+/MHC-Ⅱ检测内皮细胞中MHC分子的表达；T细胞亚群比例、来源及FasL表达：小鼠急性GVHD及BMT组移植后第14、21天胫骨单个核细胞CD8/CD4设门检测T细胞亚群比例，CD8/CD4设门后检测FasL的表达强度，检测CD45.1和CD45.2阳性比例了解T细胞的供受者来源。病理学检测移植后第7、14、21天GVHD小鼠骨髓增生程度及内皮细胞变化：采用常规HE、免疫组化染色及塑料包埋骨髓切片方法，显微镜下观察。ELISA方法检测小鼠促内皮生长因子浓度：取移植后第7、14、21天GVHD及BMT组小鼠胫骨一根，定容1ml PBS反复冲洗，收集冲洗液，常规获取小鼠血清，采用ELISA Kit检测血清及冲洗液中VEGF、SDF-1、bFGF浓度。RT-PCR方法检测小鼠骨髓窦内皮细胞Fas、Caspase-3凋亡相关基因的表达：取移植后第14天GVHD及BMT组小鼠各3组，常规获取骨髓单个核细胞，VEGFR2+/VEGFR3+/Sca-1-设门分选骨髓窦内皮细胞，数量为5-8×105，CD8/CD4设门分选CD4+/CD8-及CD4-/CD8+T细胞，数量为106， Trizol充分吹打，裂解冻存于-40℃，定制相关引物后检测。结果移植后14天、21天GVHD组小鼠每根胫骨中骨髓MNC计数均低于BMT组：移植后14天骨髓MNC计数GVHD和BMT组分别为(1.10±0.21)×107、(1.71±0.32)×107(N=4，P=0.0316)；移植后21天GVHD和BMT组分别为(0.58±0.14)×107、(2.14±0.38)×107(N=4， P=0.0076)。移植后14天、21天GVHD小鼠骨髓窦内皮细胞的比例低于BMT组：移植后14天GVHD和BMT组骨髓窦内皮细胞的比例分别为(0.145±0.132)%、(0.335±0.070)%(N=4，P=0.0253)；移植后21天GVHD和BMT组分别为(0.028±0.019)%、(0.552±0.124)%(N=4，P=0.0017)。移植后14天、21天GVHD小鼠每根胫骨中骨髓窦内皮细胞的绝对数均低于BMT组：移植后第14天GVHD和BMT组骨髓窦内皮细胞的绝对值计数分别为(1.595±0.41)×104、(5.695±0.78)×104(N=4，P=0.0037)；移植后21天GVHD和BMT组计数分别为及(0.3234±0.11)×104、(11.55±2.38)×104(N=4，P=0.0001)。移植后14天GVHD小鼠骨髓窦内皮细胞表达Ki-67的比例与BMT组比较无差异：移植后14天GVHD组和BMT组VEGFR3+/Ki-67+比例分别为(0.125±0.053)%、(0.275±0.058)%(N=4，P=0.053)。移植后14天、21天GVHD小鼠骨髓窦内皮细胞凋亡比例增高：移植后14天GVHD组和BMT组SSClow/VEGFR3+内皮细胞中Annexin V+/PI-比例分别为(39.57±2.77)%、(28.37±1.97)%(N=4, P=0.016)；移植后21天GVHD组和BMT组分别为(29.87±2.55)%、(18.47±1.72)%(N=4，P=0.010)。移植后14天、21天GVHD小鼠骨髓窦内皮细胞表达MHC-Ⅰ类分子的比例与BMT组比较无差异：移植后14天GVHD组和BMT组SSClow/VEGFR3+内皮细胞阳性表达MHC-Ⅰ比例分别为(81.62±3.64)%、(78.35±3.64)%(N=4，P=0.470)；移植后21天GVHD组和BMT组比例分别为(70.10±3.19)%、(64.27±5.13)%(N=4，P=0.372)。移植后14天、21天GVHD小鼠骨髓窦内皮细胞表达MHC-Ⅱ类分子的比例高于BMT组：移植后14天GVHD组和BMT组SSClow/VEGFR3+内皮细胞阳性表达MHC-Ⅱ比例分别为(57.32±3.61)%、(21.25±3.09)%(N=4，P=0.00035)；移植后21天GVHD组和BMT组分别为(15.60±1.25)%、(9.95±2.68)%(N=4， P=0.033)。移植后14天、21天GVHD小鼠骨髓窦内皮细胞阳性表达Fas的比例高于BMT组：移植后14天GVHD组和BMT组SSClow/VEGFR3+内皮细胞阳性表达Fas比例分别为(87.6±3.48)%、(63.92±3.76)%（N=4，P=0.0036）；移植后21天GVHD组和BMT组分别为(72.5±3.33)%、(26.55±7.17)%（N=4， P=0.0011）。移植后14天、21天GVHD小鼠骨髓CD4+T细胞阳性表达FasL的比例均高于BMT组：移植后14天GVHD组和BMT组骨髓CD4+/CD8-T细胞表达FasL比例分别为(72.8±6.24)%、(45.72±2.53)%（N=4，P=0.007）；移植后21天GVHD组和BMT组分别为(72.2±4.31)%、(31.35±7.84)%（N=4，P=0.0004）。移植后14天、21天GVHD小鼠骨髓CD8+T细胞阳性表达FasL的比例均高于BMT组：移植后14天GVHD组和BMT组骨髓CD4-/CD8+T细胞表达Fas比例分别为(56.32±3.99)%、(15.95±3.27)%（N=4，P=0.002）；移植后21天GVHD组和BMT组分别为(22.31±4.75)%、(9.82±1.11)%（N=4，P=0.043）。移植后14天GVHD及BMT小鼠骨髓CD4+T细胞来源于供者： CD8/CD4设门后检测CD4+T中CD45.1+/CD45.2+比例分别为(97.96±0.76)%、(96.57±1.10)%。病理学检测移植后GVHD小鼠骨髓增生程度及窦内皮细胞变化：HE、免疫组化染色及塑料包埋切片光镜下均可以从形态辨识骨髓窦内皮细胞，特点为沿血窦周围分布，细胞狭长，细胞核呈梭形。免疫组化VEGFR3染色窦内皮细胞胞浆呈棕色，核深染，呈梭形。塑料包埋切片从原始到成熟各阶段细胞的细胞质由蓝色至红色过度层次明显，血窦及内皮细胞形态清晰。正常小鼠骨髓有核细胞增生活跃，扁平样血窦多见，无成熟红细胞外溢至血窦外。移植后第14天PBS组小鼠骨髓增生明显受抑制，有核细胞少见，空泡为主，几乎未见血窦及内皮细胞。移植后第14天GVHD组骨髓增生受抑制，有核细胞明显减少，空泡多见，血窦数量明显减少，血窦肿胀，闭合破坏，可见成熟红细胞逸出至血窦外。第21天有核细胞进一步减少，内皮细胞偶见，血窦结构难以辨识。移植后第14天BMT组增生较活跃，有核细胞多见，血窦破坏较GVHD组减轻，可见成熟红细胞逸出至血窦外。第21天有核细胞增生活跃，血窦形态恢复，结构完整，无红细胞逸出。ELISA Kit检测GVHD组及BMT组血清及骨髓冲洗液上清中VEGF、SDF-1、bFGF浓度：冲洗液上清VEGF浓度两组间无统计学差异：移植后第7天GVHD和BMT组分别为(32.84±8.76)ng/ml、(51.08±13.18)ng/ml；移植后第14天分别为(55.64±9.23)ng/ml、(125.70±22.09) ng/ml；移植后第21天分别为(22.19±5.41)ng/ml、(50.17±13.47)ng/ml（n=3，P均>0.05）。移植后7、14天血清VEGF浓度GVHD组低于BMT组，移植后第21天VEGF浓度两组间无统计学差异：移植后第7天GVHD和BMT组分别为(125.18±4.68)ng/ml、(153.52±5.17)ng/ml (n=3，P=0.015)；移植后第14天分别为(149.16±4.71) ng/ml、(229.92±3.84) ng/ml (n=3，P=0.025)；移植后第21天分别为(179.62±45.23)ng/ml、(162.55±21.74) ng/ml(n=3，P=0.732)。冲洗液上清SDF-1浓度两组间均无统计学差异：移植后第7天GVHD和BMT组分别为(164.52±32.14)ng/ml、(178.88±23.56)ng/ml；移植后第14天分别为(156.85±32.68)ng/ml、(196.38.±30.65) ng/ml；移植后第21天分别为(139.80±26.47)ng/ml、(154.33.±45.58) ng/ml（n=3，P均>0.05）。血清SDF-1浓度两组间均无统计学差异：移植后第7天GVHD和BMT组分别为(113.78±30.13)ng/ml、(217.65±76.18)ng/ml；移植后第14天分别为(395.46±236.30) ng/ml、(563.67±146.25) ng/ml；移植后第21天分别为(278.80±97.90)ng/ml、(486.16±22.78)ng/ml（n=3，P均>0.05。冲洗液上清bFGF浓度两组间均无统计学差异：移植后第7天GVHD和BMT组分别为(181.825±47.70)ng/ml、(234.325±44.37)ng/ml；移植后第14天分别为(168.90±39.21) ng/ml、(148.70±30.01) ng/ml；移植后第21天分别为(104.07±16.77)ng/ml、(127.62±32.15) ng/ml（N=3，P均>0.05）。血清bFGF浓度两组间均无统计学差异：移植后第7天GVHD和BMT组分别为(119.57±13.49)ng/ml、(110.85±17.44)ng/ml；移植后第14天分别为(83.58±14.04)ng/ml、(211.03±40.08) ng/ml；移植后第21天分别为(222.34±73.07)ng/ml、(111.44±17.93)ng/ml（n=3，P均>0.05）。RT-PCR方法检测GVHD组移植后第14天小鼠骨髓内皮细胞Fas，Caspase-3表达高于BMT组：GVHD组Fas相对表达量均数为：0.2536±0.021(N=3)，BMT组相对表达量均数为：0.0852±0.013(N=3)。GVHD组Caspase-3相对表达量均数为：0.2910±0.086(N=3)，BMT组相对表达量均数为：0.0323±0.012(N=3)。小结以上实验证实半相合移植GVHD小鼠与BMT组比较，骨髓MNC减少、窦内皮细胞数量比例下降；供者CD4+和CD8+T细胞表达FasL升高，内皮细胞高表达Fas，实验证明内皮细胞凋亡增加，增殖变化不明显，促血管生长因子除VEGF外，其他无差异，GVHD组小鼠骨髓内皮细胞Fas, Caspase-3表达相对升高，内皮细胞表达以MHC-Ⅱ类分子为主，提示CD4+T细胞通过Fas/FasL途径引起受者骨髓内皮细胞凋亡。