低氧是指供氧不能满足机体对氧需要的状态。此时，根据低氧的不同形式，从全身、局部和细胞几方面产生不同的应答反应来维持机体内环境的稳定。这些反应包括: (1) 红细胞生成增加(个体在贫血或在高原状态时); (2) 新生血管形成(心肌缺血时);(3) 糖酵解(培养细胞氧分压降低时)等。这些适应性反应既增加了氧的传递，又激活了不需氧的代谢旁路，使机体能更好的适应低氧环境。因此，对低氧应答反应机制的研究就显得尤为重要。 低氧诱导因子家族（hypoxia inducible factors,HIFs；包括HIF-1α，HIF-2α，HIF-3α）是机体低氧应答过程中起重要作用的转录因子，在细胞的低氧适应过程中发挥中心环节的作用。本研究者在硕士研究生期间通过动物试验和临床标本发现HIF-1α，HIF-2α和HIF-3α在人和大鼠的肺部表达有明显的差异和分区现象。目前为止，在肺上皮细胞，低氧对HIF-1α和HIF-2α调控作用人们已有了较深入的了解。但低氧对HIFs中另一成员HIF-3α是否有诱导作用，和HIF-1α有何差异，产生差异具体机理怎样？则未知；且最近的研究表明临床常用的吸入麻醉药异氟醚可调控HIF-1α下游靶基因如血管内皮生长因子（VEGF），血红素氧合酶-1(HO-1)和诱导性一氧化氮合酶（iNOS）的表达，但异氟醚可否调控HIF-1α的基因表达和活性，具体机理如何？对HIF-1α靶基因的调控作用是否有HIF-1α信号通路的参与也未知；有待深入研究。 本研究分两部分： 第一部分低氧上调低氧诱导因子(HIF)-3a及异氟醚对HIF-1 a的差异性调控作用 目的：研究低氧是否可在肺上皮细胞诱导HIF-3α的基因表达，低氧对HIF-3α的调控作用和HIF-1α的差异及其原因。 方法: 肺上皮细胞系A549 细胞在常氧，低氧或化学模拟低氧剂CoCl2 和DFX 处理下培养不同时间，采用实时定量PCR 和免疫印迹检测低氧对HIF-3α和HIF-1α基因的激活作用。通过加入基因转录阻断剂DRB 和蛋白合成阻断剂CHX 来探讨低氧对HIF-3α和HIF-1α基因表达差异性调控的机理。 结果: 常氧下，HIF-3α mRNA 几乎检测不到，但可检测到HIF-1α mRNA，2h 低氧培养对HIF-3α和HIF-1α mRNA 无影响。 常氧下全细胞提取物和细胞核提取物均检测不到HIF-1α蛋白，但HIF-3α蛋白有低水平的表达。2h 低氧培养可诱导HIF-1α和HIF-3α蛋白表达，低氧性诱导作用与低氧培养时间，细胞密度和氧浓度有关。HIF-1α蛋白在低氧2h 后增加，低氧4h 后进一步增多，但在8h 后蛋白量下降，16h 后回到对照组0h 的水平。 相反，HIF-3α蛋白水平在低氧8h 后到达高峰，低氧16h 后HIF-3α 蛋白仍维持在8h 时的水平。CoCl2 处理和低氧处理A549 细胞所得的结果相似。同时发现，持续低氧对HIF-3α和HIF-1α mRNA的表达调控也明显不同。尽管2h 的低氧对HIF-3α和HIF-1α mRNA 表达没有影响。但随着低氧时间的延长，低氧可显著的调控HIF-3α和HIF-1α mRNA 的表达，且HIF-3α和HIF-1α mRNA的动态变化不同。低氧从4h 到16h，定量实时PCR 发现HIF-1α mRNA 显著降低，而在相同的时间段，HIF-3α mRNA 水平则明显升高，化学模拟低氧剂CoCl2 和DFX 均可浓度依赖性诱导HIF-1α和HIF-3α蛋白表达。活性氧族阻断剂可部分阻断常氧下和低氧对HIF-1α和HIF-3α的诱导作用。低氧(1％ O2)上调HIF-3α 蛋白和mRNA 水平，是通过增加蛋白稳定性和转录激活实现的； 而由于HIF-1αmRNA 稳定性下降，低氧仅短暂的增加HIF-1α蛋白和mRNA 水平。 结论: 低氧可在肺上皮细胞诱导HIF-3α基因表达，转录激活过程在低氧对HIF-3α的诱导中发挥重要作用。在肺上皮细胞，作为低氧诱导因子家族成员，HIF-3α在细胞低氧适应反应过程中发挥的转录激活作用可能是与HIF-1α互补而不是重复。 第二部分异氟醚对HIF-1 a基因表达和活性的调控作用 目的: 研究异氟醚对HIF-1α基因表达和转录活性的调控作用及其调控机理。 方法: 不同浓度(0.5–4％)和不同时间点(2–8 h)的异氟醚在37°C处理Hep3B 细胞，实时定量PCR和免疫印迹检测HIF-1α、血红素氧合酶（heme oxygenase 1，HO-1）、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF)、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase ，iNOS）基因表达和报告基因分析检测HIF-1α转录活性；通过加入蛋白合成阻断剂CHX，蛋白降解阻断剂MG132和RNA干扰技术来探讨异氟醚调控HIF-1α的具体分子机制。 结果: 在Hep3B 细胞，异氟醚呈时间和浓度依赖性诱导HIF-1α蛋白表达，但对HIF-1αmRNA表达无影响。2％的异氟醚可发挥最大程度的诱导作用，2％异氟醚处理细胞4-8h时，HIF-1α 蛋白表达最多。异氟醚处理细胞16h后HIF-1α转录活性显著升高。 2％异氟醚和DFX（化学模拟低氧剂，100μM）同时处理细胞可进一步增加HIF-1α蛋白水平。复氧和蛋白酶体通路阻断剂MG132（50μM）不影响异氟醚对HIF-1α蛋白的诱导作用；蛋白合成抑制剂CHX（100μM）则阻断异氟醚对HIF-1α蛋白的诱导作用。同时异氟醚呈浓度依赖性诱导HO-1， VEFG和iNOS mRNA表达以及VEGF蛋白表达，RNA干扰沉默HIF-1αmRNA表达的同时可部分阻断异氟醚对VEGF mRNA的诱导作用。 结论: 在Hep3B细胞，异氟醚可上调HIF-1α蛋白表达和转录活性，提高HIF-1α下游靶基因VEGF，HO-1和iNOS mRNA水平。 异氟醚对HIF-1α的诱导作用是通过蛋白翻译途径而不是对蛋白降解过程的阻断来实现的。