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背景:缺血心肌恢复血液灌注后反而会加重组织损伤,这种现象被称为心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)。心脏血供阻塞后溶栓、介入等治疗后可能会发生MI/RI现象,如再灌性心律失常、心肌舒缩功能障碍、心肌出血坏死等功能障碍及结构损伤。糖尿病患者在接受再灌注治疗时相较于非糖尿病患者更易发生MI/RI,且损伤程度更为严重。因此,深入探讨糖尿病状态下MI/RI的发生机制,寻找精准的干预靶点减轻MI/RI,有着十分重要的意义。我们前期研究表明,糖尿病(db/db)小鼠I/R模型中心肌缺血区高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)表达上调,且线粒体损伤程度加重。而HMGB1与线粒体损伤及自噬密切相关。因此,本实验拟建立db/db小鼠和C57 BL/6小鼠的MI/RI模型,并进一步注射中和抗体降低HMGB1表达后检测心肌损伤程度,并利用线粒体形态分析、线粒体膜电位检测、激光共聚焦等技术,检测线粒体自噬及自噬程度,以阐明HMGB1介导线粒体损伤及自噬在糖尿病时MI/RI中的具体机制。第一部分研究HMGBI与糖尿病(db/db)小鼠MI/RI损伤程度的关系目的:研究HMGB1水平与db/db小鼠MIRI损伤程度的关系方法:将20只C57 BL/6小鼠与20只db/db小鼠分别随机分到I/R组、假手术(Sham)组,每组10只,分别为:db/db小鼠-I/R组(D-I/R组)、db/db 小鼠 Sham 组(SD 组)、C57 BL/6 小鼠-I/R 组(C-I/R 组)、C57 BL/6小鼠-Sham组(SC组)。Sham组行假手术处理;I/R组结扎冠状动脉左前降支(left anterior descending artery,LAD)使小鼠心肌缺血 30 min 后,松开活结恢复血流再灌满24h。再灌注结束后使用行伊文思蓝(Evansblue)-2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)双重染色、苏木精伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色检测小鼠心肌损伤情况;使用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠血液内肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase MB,CK-MB)、心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ,cTnI)和HMGB1的含量;利用透射电子显微镜观察线粒体形态变化;通过冰冻切片活性氧族(reactive oxygen species,ROS)染色观察心肌组织ROS的生成;通过实时蛋白质印迹(Western Blotting)检测心肌组织HMGB1、自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、线粒体自噬相关蛋白Pink1、Parkin的表达水平。结果:(1)与C-I/R组比较,D-I/R组小鼠心梗面积显著增多(P<0.05)。(2)HE染色显示:与SC组比较,D-I/R组与C-I/R的小鼠心肌切片出现明显的心肌组织损伤;与C-I/R组比较,D-I/R组心肌梗死区心肌深染,横纹消失,交界区充血,大量炎性细胞浸润,提示更为明显的心肌组织损伤。(3)Elisa试验显示:与SC组比较,D-I/R组与C-I/R的小鼠血清CK-MB、cTnI、HMGB1水平升高(P<0.05);与C-I/R组比较,D-I/R组小鼠血清CK-MB、cTnI、HMGB1水平明显上调(P<0.05);(4)透射电镜观察下,SC组与SD组心肌线粒体表现为正常的形态,D-I/R组与C-I/R组出现损伤线粒体;与C-I/R组比较,D-I/R组小鼠线粒体损伤更为严重。(4)透射电镜观察下,SC组与SD组心肌线粒体表现为正常的形态,D-I/R组与C-I/R组出现损伤线粒体;与C-I/R组比较,D-I/R组小鼠线粒体损伤更为严重。(5)与SC组比较,D-I/R组与C-I/R的小鼠缺血心肌冰冻切片ROS染色阳性荧光强度明显上升(P<0.05);与C-I/R组比较,D-I/R组小鼠的ROS染色阳性荧光强度显著上调(P<0.05)。(6)WB结果显示:相较于SC组,D-I/R组与C-I/R的小鼠缺血心肌HMGB1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Pink1、Parkin 蛋白水平升高(P<0.05);与 C-I/R 组比较,D-I/R组小鼠心肌组织中HMGB1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Pink1、Parkin蛋白的表达水平升高更为明显(P<0.05)。结论:db/db小鼠MI/RI时缺血区及体内循环HMGB1表达量增高;且缺血区面积及心肌损伤程度较非糖尿病小鼠更为严重,并伴有更为明显的线粒体损伤及线粒体自噬水平的增高。第二部分探索HMGBI是否通过介导线粒体损伤及自噬而加重db/db小鼠MI/RI目的:探索HMGB1是否通过介导线粒体损伤及自噬而加重db/db小鼠MI/RI方法:将40只db/db小鼠随机分到I/R-对照空载抗体组(IG组)、I/R-中和抗体组(IA组)、Sham-对照空载抗体组(SG组)、Sham-中和抗体组(SA组),每组10只。SA组行假手术处理1h后尾静脉注射HMGB1中和抗体(2mg/kg);SG组行假手术处理1h后尾静脉注射Ig-Y对照空载抗体(2mg/kg);IA组结扎LAD,使得心肌缺血30min。松开活结恢复血流灌注30min后尾静脉注射HMGB1中和抗体(2mg/kg),直至血流灌注满24h;IG组予同IA组处理,恢复血流灌注30min后尾静脉注射Ig-Y对照空载抗体(2mg/kg)。使用Evansblue-TTC双重染色和HE染色检测小鼠心肌损伤情况;Elisa试验检测小鼠血清CK-MB、CTnI、HMGB1表达水平;利用透射电子显微镜观察线粒体形态变化;5,5’,6,6’-四氯-1,1’,3,3’-四乙基苯并咪唑基-羰化青碘(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolyl-carbocyanineiodide,JC-1)染色检测线粒体膜电位;免疫荧光共定位检测心肌组织中LC3蛋白与线粒体基质蛋白HSP60共定位表达情况及线粒体自噬相关蛋白Pink1/Parkin表达情况;WB法检测心肌组织中HMGB1、自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ、线粒体自噬相关蛋白Pink1、Parkin的表达情况。结果:与SG组相比较:(1)Elisa试验显示IA、IG组中CK-MB、cTnI、HMGB1血清浓度水平升高(P<0.05);(2)JC-1染色结果表明:IA、IG组缺血心肌组织中线粒体膜电位水平明显降低(P<0.05);(3)WB结果显示:IA、IG组缺血心肌组织中HMGB1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Pink1、Parkin 蛋白水平升高(P<0.05)。与IG组比较:(1)IA组心梗面积和血清中CK-MB、CTnI、HMGB1的表达水平明显降低(P<0.05);(2)IA组小鼠电镜下观察到损伤相对较轻的线粒体;(3)JC-1染色结果表明IA组线粒体膜电位相对下降(P<0.05);(4)WB结果表明心肌组织中HMGB1、LC3-Ⅱ/Ⅰ、Pink1、Parkin蛋白的表达水平明显下降(P<0.05);(5)LC3与线粒体共定位免疫荧光染色显示IA组缺血心肌组织中,线粒体自噬下降;(6)Pink1/Parkin蛋白免疫荧光双标显示IA组缺血心肌组织中Pink1与Parkin共表达情况下降。结论:HMGB1可能通过介导线粒体损伤和自噬而加重db/db小鼠的MI/RI损伤。