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研究背景肝纤维化(hepatic fibrosis)是各种慢性肝病进展中由于过量的细胞外基质包括胶原等在肝内异常沉积造成的,并可进一步发展为肝硬化、肝癌。间质细胞如肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)、Kuffer细胞、肝门成纤维细胞等均可促进肝纤维化形成,而肝星状细胞是主要的胶原纤维来源。肝星状细胞处于Disse腔中,正常情况下呈静止状态,储存维生素A相关脂滴,当肝脏实质受到慢性损伤时,肝脏细胞、Kupffer细胞、内皮细胞、浸润的炎症细胞等可使肝星状细胞活化,HSCs的活化是肝纤维化形成的重要环节。当HSCs活化后,α-SMA(alpha-smooth muscle actin)、胶原蛋白(collagen)和胶原降解酶如金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)等强烈表达,此过程的持续使得胶原沉积和肝功能损伤最终导致肝纤维化。脊柱动物转化生长因子(transforming growth factor,TGF)β共有3种:TGF-β1、2、3,肝脏中含量最高并且具有生物活性的是TGF-β1。TGF-β1是一簇结构密切相关、功能相似的活性多肽,在人体内具有多种生物学功能,与多种组织或器官的纤维化性疾病密切相关。当肝脏发生病变时,TGF-β1是一种强效的促纤维化的细胞因子,通过活化肝星状细胞,刺激细胞外基质的合成并抑制其降解而促进纤维化的形成。早期的研究表明在颗粒细胞和乳腺癌细胞中TGF-β1可促进甲状旁腺激素相关蛋白(Parathyroid hormone-related protein,PTHrP)的分泌,而近期有研究表明TGF-β1亦可促进肝癌细胞中PTHrP的分泌。PTHrP是一种多肽类物质,最初是从引起高钙血症的恶性肿瘤组织中分离出来的,与甲状旁腺激素(Parathyroid hormone,PTH)有着相似的结构。近年来PTHrP的研究大多致力于骨骼和肿瘤方面,并已证实其具有促进骨质形成的作用,临床上已应用PTHrP作为促进骨质合成剂治疗骨质疏松症,并取得了良好的治疗效果。早有研究显示慢性肝病伴内毒素血症时肝细胞中PTHrP明显升高并可造成肝细胞的急性损伤。最近有研究表明PTHrP可促进肾纤维化的发生,且此作用与细胞因子TGF-β1、内皮生长因子(endothelial growth factor,EGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等相关;在蛙皮素或者乙醇诱发的急性胰腺炎中PTHrP升高,PTHrP可促进胰腺星状细胞分泌前Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白及炎症因子IL-6的产生,进而促进胰腺纤维化。我们前期工作已证实PTHrP可以活化HSCs,促进TGF-β1及纤维因子的分泌。肝纤维化是多条细胞信号通路共同参与的复杂的病理过程,目前研究较为清楚的主要有TGF-β-Smad信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路、Rho-ROCK信号通路等。各种信号通路在不同的环节发挥作用,共同促进肝纤维化的发生及发展。MAPK的成员主要有细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-jun 氨基末端激酶(c-junN-terminal kinase,JNK)及 p38 激酶三个亚族构成。TGF-β1 可通过 Smad及MAPK通路调节细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的基因表达,促进其过量合成并抑制其降解,最终导致肝纤维化的发生。TGF-β1为公认的促肝脏纤维化因子,而PTHrP作为一种前景良好的骨形成促进剂,却亦具有促肝脏纤维化的作用。根据国内外研究现状以及本课题组前期的研究结果,我们提出以下假设:PTHrP与TGF-β1在肝纤维化中有正反馈调节作用,可形成正反馈环路,激活Smad、MAPK等信号通路,进而促进肝纤维化形成。这一假设如能证实,不仅能进一步明确PTHrP与TGF-β1之间的关系,加深对肝纤维化的认识,还有助于阐明PTHrP与TGF-β1诱发肝纤维的病理机制,为肝纤维化的防治提供新的途径及靶点。研究目的和意义肝星状细胞的活化一直是肝纤维化研究中的热点,因此TGF-β1与PTHrP的相互作用以及对肝星状细胞的影响给我们提供了一个新的研究切入点,可为肝纤维化治疗手段提供新的药理学依据,亦可揭示TGF-β1与PTHrP引起肝纤维化的病理机制。材料和方法1、商业购买人肝星状细胞一株,为人肝星状细胞LX-2,予以不同浓度的TGF-β1(1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、50ng/ml)及 TGF-β1(10ng/ml)处理不同时间段(1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h),后收集细胞总蛋白、总 RNA;2、运用普通逆转录-聚合酶链式反应技术(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)及相对定量逆转录-聚合酶链式反应技术(comparative quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR)在基因水平检测上述处理后细胞产物的活化相关因子(PTHrP、collagen I、MMP-2),蛋白质印迹方法(Western-blot)在蛋白水平检测上述处理后细胞产物的活化相关因子(PTHrP、collagen I、MMP-2、Smad2/p-Smad2、Smad3/p-Smad3、Smad1/p-Smad1、Smad5/p-Smad5、JNK/p-JNK、p44/42/p-p44/42、p38/p-p38);3、运用细胞免疫荧光方法(Immunofluorescence)检测TGF-β1(10 ng/ml)处理LX-2细胞48h后PTHrP的表达情况,TGF-β1受体抑制剂LY2157299、p38通路抑制剂SB203580处理LX-2细胞后检测TGF-β1(10 ng/ml)对LX-2细胞PTHrP表达的影响。PTHrP抑制剂PTHrP(7-34)处理LX-2细胞后TGF-β1(10 ng/ml)对 LX-2 细胞 collagen I、MMP-2 表达的影响;4、统计学分析:所有数据均采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析,各组间差异比较采用多样本均数比较方差分析(ONEWAY-ANOVA),方差齐时采用Dunnett和Bonferroni方法,方差不齐时采用Dunnett T3检验方法。结果以均数±标准差的方式表示,其中RT-qPCR结果及Western-blot结果对照组统一量化为1,所有统计结果以P<0.05为具有显著性差异。研究结果1、我们从基因及蛋白水平检测了 TGF-β1处理LX-2细胞,发现在浓度1 ng/ml处理48h时PTHrP基因表达为对照组的3.2倍(P<0.05),蛋白为对照组的3.3倍(P<0.01);5-50 ng/ml处理48h的条件下基因表达为对照组的13.2-14.6倍(P<0.01),蛋白为对照组的 5.0-7.4 倍(P<0.01)。TGF-β1(10 ng/ml)处理 LX-2细胞1-96h的条件下,PTHrP基因表达均高于对照组(P<0.01),3h作用最为明显,为对照组的 5.5 倍(P<0.01)。TGF-β1(10ng/ml)处理LX-2 细胞 3-96h的条件下,PTHrP蛋白6h-24h处于上升期,为对照组的1.3-2.3倍(P<0.01);48-96h增加最为显著,为对照组的3.1-3.4倍(P<0.01);3h与对照组无统计学差异,48-96h组间无统计学差异。2、TGF-βl(10 ng/ml)处理 LX-2 细胞后检测 Smad、JNK、ERK(p44/42)和 p38通路。p-Smad2在10min-24h表达高于对照组(P<0.01),30min时达高峰,为对照组的46.6倍(P<0.01),1h后开始下降;p-Smad3在10min-24h表达亦高于对照组(P<0.01),在10-30min时最显著,为对照组的24.1-25.3倍(<0.01),1h后开始下降;p-Smad1在10min时开始升高,10-30min为对照组的3.8-13.4倍(P<0.01),1h达高峰为对照组的21.1倍(P<0.01),3-6h为对照组的2.2-2.4倍(P<0.05),12-24h与对照组无统计学差异;p-Smad5趋势与p-Smad1相同,在10min时开始增加,10-30min为对照组的3.4-7.4倍(P<0.01),1h达高峰为对照组的12.8倍(P<0.01),3-6h为对照组的1.8倍(P<0.05),12-24h与对照组无统计学差异;p-JNK在12h时开始增加,24-72h处于平台期时,为对照组的2.9-3.1倍(P<0.01),96h处于下降期,为对照组的1.9倍(P<0.01),3-6h与对照组无统计学差异;p-p44/42 6-96h为对照组的3.6-10.0倍(P<0.01),3h与对照组无统计学差异。p-p38 3-96h为对照组的3.9-5.7倍(P<0.01)。3、TGF-β1(10 ng/ml)处理 LX-2 细胞前 2h 予 TGF-β1 受体抑制剂:TGF-β1 I型受体抑制剂SD208(2μM,10μM)或者TGF-β1 Ⅰ/Ⅱ型受体抑制剂LY2157299(4μM,10μM),发现应用 SD208 10μM)+TGF-β1 组引起的 PTHrP 基因为对照组的2.3-3.2倍、蛋白为对照组的1.5-1.8倍,与TGF-β1组及对照组均有统计学差异(P<0.01);应用 LY2157299(4μM,1OμM)+TGF-β1 组引起的 PTHrP 基因及蛋白表达与TGF-β1组有统计学差异(P<0.01),与对照组无统计学差异。TGF-β1(10 ng/ml)处理LX-2细胞前2h予p38通路抑制剂SB203580,发现SB203580(20μM)+TGF-β1组引起的PTHrP基因为对照组的4.9倍、蛋白为对照组的3.0倍,与TGF-β1组及对照组均有统计学差异(P<0.05);SB203580(50μM)+TGF-β1组引起的PTHrP基因及蛋白表达与TGF-β1组有统计学差异(P<0.01),与对照组无统计学差异。TGF-β1(10ng/ml)处理LX-2细胞前2h予JNK通路抑制剂 SP600125 及 p44/42 通路抑制剂 PD98059,发现 SP600125(10μM,20μM)+TGF-β1 组和 PD98059(10μM,25μM)+TGF-β1 组 PTHrP 基因及蛋白的表达与TGF-β1组无统计学差异,与对照组有统计学差异(P<0.01)。4、TGF-β1(10 ng/ml)处理 LX-2 细胞前 2h 予 PTHrP 抑制剂 PTHrP(7-34),发现 PTHrP(7-34)(0.5μM)+ TGF-β1 组与 TGF-β1 组 collagen Ⅰ 基因、蛋白和MMP-2 基因、蛋白均无统计学差异。PTHrP(7-34)(1μM)+ TGF-β1 组 collagenⅠ基因为对照组的7.0倍、蛋白为对照组的2.3倍,均与TGF-β1组及对照组均有统计学差异(P<0.05);PTHrP(7-34)(11μM)+TGF-β1 组MMP-2基因为对照组的3.3倍、蛋白为对照组的1.4倍,与TGF-β1组及对照组均有统计学差异(P<0.05)。5、应用细胞免疫荧光方法检测TGF-β1(10 ng/ml)处理LX-2细胞后,发现处理组与对照组相比PTHrP表达明显升高;应用TGF-β1(10 ng/ml)处理LX-2细胞前 2h 予 LY2157299 10μM、SB203580 50μM,发现 LY2157299 + TGF-β1 组、SB203580 + TGF-β1组较TGF-β1组PTHrP表达明显下降,与对照组无明显差异;TGF-β1(10 ng/ml)处理 LX-2 细胞前 2h 予 PTHrP(7-34)1μM,发现 PTHrP(7-34)+ TGF-β1组较TGF-β1组MMP-2及Ⅰ型胶原表达明显降低,但仍高于对照组。主要结论1、TGF-β1可促进LX-2细胞PTHrP基因及蛋白的表达,基因于浓度5-50 ng/ml、蛋白于浓度30-50 ng/ml时上述效应最显著;TGF-β1(10 ng/ml)处理1-96h均高于对照组,3h达高峰;TGF-β1(10ng/ml)处理6h时PTHrP蛋白表达开始升高,48-96h升高最明显。2、TGF-β1(10ng/ml)处理 LX-2 细胞后 Smad、JNK,ERK 和 p38 通路被激活。p-Smad2在10min开始升高、30min达高峰、1h后开始下降,p-Smad3在10min即达高峰、1h后开始下降,p-Smad1/5在10min开始升高、1h达高峰、3h后开始下降;p-JNK在12h开始升高,24h达高峰,96h后开始下降;p-p44/42在6h开始升高,p-p38在3-96h持续升高。3、TGF-β1调节PTHrP基因及蛋白表达与TGF-β1受体及p38通路有关。TGF-β1Ⅰ型受体抑制剂SD208(2μM,10pM)可以部分阻断TGF-β1引起的PTHrP基因及蛋白的表达;TGF-β1 Ⅰ/Ⅱ型受体抑制剂LY2157299(4μM,10μM)及p38抑制剂SB203580(50μM)可以完全阻断TGF-β1引起的PTHrP基因及蛋白的表达;未发现JNK通路抑制剂SP600125及p44/42通路抑制剂PD98059对TGF-β1引起的PTHrP基因及蛋白表达有影响。4、PTHrP 抑制剂 PTHrP(7-34)(1μM)可部分阻断 TGF-β1 引起的 collagen Ⅰ 及MMP-2基因及蛋白表达。5、TGF-β1与PTHrP对LX-2细胞可形成正反馈调节作用,共同促进肝纤维化形成。