中药复方“小续命汤”最早见于汉魏两晋时期著名医家陈延之的《小品方》,方由:防风、附子、生姜、杏仁、麻黄、人参、桂枝、芍药、川芎、防己、黄芩、甘草12味中药组成。该方具有“温经通阳,扶正驱风”的功能,主要用于治疗中风及中风后遗症。小续命汤具有良好的临床疗效和长期应用的历史,是中药复方中极具代表性的方剂之一。近年来研究显示,小续命汤不仅对中风及中风后遗症具有明显的治疗作用,对阿尔茨海默病、糖尿病周围神经病变、顽固性高血压等其他疾病也具有一定疗效。随着近现代科技对中药及中药复方的不断深入研究,为了能够在理论上更好的阐述中药复方治疗作用的物质基础和作用模式,中药复方有效成分组的理念应运而生。中药复方中的有效成分是中药复方发挥治疗作用的基础,既不是简单的活性部位,也不是无序的有效部位群,而是能够体现中医药组方理论的有效成分的有机组合,是一个完整的有效成分组合,称为有效成分组。本课题以能够反应经典复方“小续命汤”疗效的有效成分组——小续命汤有效成分组为研究对象,通过对其物质基础、血浆中多成分方法学的建立、药物代谢动力学研究及蛋白质组学初探,对小续命汤在物质基础及生物学基础研究提供了有效的参考依据。为了阐述该复方的药效物质基础和作用机制,本课题通过UPLC/Q-TOF-MS技术,从小续命汤有效成分组中鉴定了 42个化合物,主要包括黄酮类、生物碱类、三萜皂苷类成分,并归属了各化合物的单味中药来源。在物质基础研究的基础上,针对小续命汤有效成分组中37种化合物建立了大鼠血浆中LC-MS/MS检测方法,对该方法进行了血浆中专属性、准确度、精密度、提取回收率、基质效应等方法学验证。本方法具有灵敏度高、准确性好、重复性强、响应值高等优点。而后利用该检测方法测定了大鼠血浆中汉黄芩素、千层纸素A苷、汉黄芩苷、甘草素、千层纸素A、黄芩苷等11种小续命汤成分的浓度,描述其药物代谢动力学特征、并计算药代参数。在物质基础及药物代谢研究的基础上,为了进一步探讨其生物学基础及小续命汤可能存在的靶点和生物体调控通路,本课题应用UPLC-Q-Exactive技术的蛋白质组学法探索小续命汤有效成分组对大鼠局灶性脑缺血作用的生物学基础,寻找相关蛋白靶点及其涉及的生物体调控通路,为小续命汤有效成分组对治疗局灶性脑缺血的生物学基础提供参考依据。1.对近年来国内外文献进行查阅,梳理汇总中药复方小续命汤的物质基础、药理作用及临床应用情况。小续命汤在唐宋时期曾为治风之首剂,被古时医家尊为治疗中风的要剂,该方含有十二味中药,组方相对复杂,且其物质基础研究及药效机制研究尚不深入。通过筛选、分析小续命汤物质成分基础,探讨其在体内复杂变化,以及对小续命汤的药理效应和临床应用进行阐述。旨为对小续命汤这一中药复方提供更为深入、全面的认识,并对实验的后续工作提供依据和参考。2.为了快速阐明中药复方小续命汤的化学组成,利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱联用技术(UPLC/Q-TOF-MS)对小续命汤有效成分组进行了快速分析和成分鉴定。液相条件:WatersACQUITYUPLCHSST3(2.1×100mm,1.8μm)色谱柱,以0.1%甲酸水-乙腈为流动相进行梯度洗脱,柱温40℃,流速0.35mL·min-1;质谱条件:采用ESI源,正、负离子模式下分别进行数据采集。通过与对照品信息的提取辨识、与数据库数据的匹配指认以及对文献资料的比照分析,从小续命汤有效成分组中鉴定了 42个化合物,主要包括黄酮类、生物碱类、三萜皂苷类成分,并归属了各化合物的单味中药来源。本研究比较全面地阐明了小续命汤有效成分组的化学组成,为此中药复方的质量控制提供参考,也为其深入的药效物质基础及药理作用研究奠定了基础。3.建立了小续命汤有效成分组中37个化合物血浆中LC-MS/MS检测方法,并对该方法进行了血浆中专属性、准确度、精密度、提取回收率、基质效应等方法学验证。选用 Agilent Poroshell 120 SB-C18色谱柱(2.1×100mm,2.7μm),乙腈和 0.1%甲酸-水作为流动相,梯度洗脱,流速为0.35mL·min-1,进样量为10μL。采用电喷雾离子源(ESI),扫描方式为多反应离子监测(MRM)。本实验LC-MS/MS测定方法具有灵敏度高、准确性好、重复性强、响应值高等优点。血浆中37种化合物的的线性范围适用于检测,提取回收率稳定,基质效应符合相关要求。本方法符合生物样品检测要求,适用于血浆中药物浓度的测定并进行药代动力学研究。4.经HPLC-MS/MS测定,小续命汤有效成分组黄酮类成分含量分别为汉黄芩素0.31%、千层纸素A苷0.69%、汉黄芩苷0.93%、甘草素0.04%、千层纸素A0.17%、黄芩苷0.17%、黄芩素0.98%、异甘草苷0.15%,麻黄碱0.45%、升麻素0.12%、5-O甲基阿米醇苷0.31%。利用HPLC-MS/MS测定大鼠灌胃小续命汤有效成分组后,血浆中汉黄芩素、千层纸素A苷、汉黄芩苷、甘草素、千层纸素A、黄芩苷、黄芩素、异甘草苷、麻黄碱、升麻素、5-O甲基阿米醇苷的浓度,采用WinNonLin软件非房室模型计算药代动力学参数。从药时曲线可知,大鼠体内的汉黄芩苷、千层纸素A苷、千层纸素A、黄芩苷与异甘草苷均存在明显的双峰现象,这与文献的报道基本一致,并推测这些成分在体内是由于肝肠循环或苷与苷元之间的生物转化产生,而这些化合物的双峰现象无疑会增加和维持各成分在体内较高的血药浓度,进而有助于小续命汤有效成分组发挥疗效。5.应用UPLC-Q-Exactive技术的蛋白质组学法探索小续命汤有效成分组对大鼠局灶性脑缺血作用的生物学基础,采用插线法制备大鼠右侧大脑中动脉缺血(MCAO)模型,运用UPLC-Q-Exactive纳升液相-质谱联用检测系统分析空白组、缺血模型组、小续命汤组大鼠右侧大脑皮层全蛋白。Mascot和Proteome Discoverer软件进行蛋白质鉴定及相对定量分析。空白对照组和MCAO模型组比较获得789个差异蛋白,MCAO模型组和小续命汤组比较获得702个差异蛋白,通过生物学功能分析发现,这些差异蛋白主要可归为参与细胞转化、生物调节、代谢过程、应激反应、细胞组分组成与合成、免疫系统过程。以上相关蛋白靶点及其涉及的生物体调控通路可能是小续命汤有效成分组对治疗局灶性脑缺血发挥作用的生物学基础。