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结肠癌与直肠癌同属大肠癌,是世界上第三大恶性肿瘤。在欧美发达国家中,结直肠癌的发病率高达35-50/10万,在恶性肿瘤相关死亡率中居第三位。其中直肠癌较结肠癌发病率高,约1.5：1,显示两者发病率逐渐接近。在国内,由于人民群众生活水平的提高及饮食结构的改变,发病率一直在上升,结直肠癌在恶性肿瘤中的发病率和死亡率构成比中分别为10.56%及7.8%,分别居第三位及第五位,直肠癌与结肠癌比例接近,男性比重较大。因此大肠癌的发现、诊断及治疗日益受到人们的关注。手术治疗仍是结直肠癌的主要治疗手段,全直肠系膜切除术(TME)已成为了直肠癌的标准治疗术式,但全结肠系膜切除术(CME)也能有效的降低局部复发率,但患者常因手术创伤过大,影响生活质量。为提高手术的切除率及保肛率,术前辅助放射治疗已经得到广泛开展；对于不能够手术的或手术无法全面切除的患者,则可给予术后放射治疗、抗肿瘤化学治疗、生物治疗等综合手段以尽可能的减灭肿瘤,提高局控率、延长生存期。因此放射治疗在结直肠癌患者治疗全程中起着举足轻重的地位,然而选择运用有效的放射增敏药物已成为目前研究的重点。细胞凋亡是一个复杂的生物现象,是由多个基因共同控制的,Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。已有研究表明COX-2抑制剂能够提高Caspase-3的蛋白表达水平,从而引起细胞凋亡率上升,然而EGFR及COX-2胞内信号转导存在交叉对话,两者的表达能够相互调节,而且COX-2能过激活EGFR信号途径。COX-2抑制剂与抗EGFR单克隆抗体可能协同上调Caspase-3的蛋白表达水平。本实验拟通过体外研究比较单独应用西妥昔单抗、塞来昔布与两者联合应用放射线后,对人结直肠癌HT-29细胞株增殖、凋亡及细胞周期分布的影响及HT-29细胞中Caspase-3的蛋白表达水平的变化,为结直肠肿瘤放疗增敏药物的临床应用提供实验基础。实验方法1MTT法检测西妥昔单抗与塞来昔布及两药联用对人结直肠腺癌HT-29细胞株增殖的抑制率；2平板克隆形成实验检测西妥昔单抗与塞来昔布两药联用对人结直肠腺癌HT-29细胞株放射敏感性的影响；3流式细胞技术检测西妥昔单抗与塞来昔布两药联用对人结直肠腺癌HT-29细胞株的细胞周期及凋亡率影响；4蛋白免疫印迹法检测人结直肠腺癌HT-29细胞株经过西妥昔单抗与塞来昔布联合放射线后Caspase-3表达量的变化。实验结果1MTT实验结果显示：将西妥昔单抗药物浓度分为25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1600μg/ml及空白对照组,分别作用于人结直肠腺癌HT-29细胞株24h后,细胞增殖抑制率分别为：3.57%,20.11%,32.99%,47.36%,53.75%,68.79%，83.92%,MTT法测得西妥昔单抗作用于HT-29细胞24h后的IC50浓度为281μg/ml；将塞来昔布药物浓度分为100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml、1600μg/ml、3200μg/ml、6400μg/ml及空白对照组,应用同样的方法测得塞来昔布作用于HT-29细胞24h后的IC50浓度为2720μg/ml;将西妥昔单抗与塞来昔布按照1：2、1：1、2：1的比例进行配比,作用于HT-29细胞24h后,其IC50值分别为：632μg/ml、351μg/ml、193μg/ml。且两药联用组的细胞生长抑制率明显高于单纯用药组,具有统计学意义(P<0.05)。2克隆形成实验结果显示：两药联用25μg/ml及50μg/ml附加照射组的DO值(平均致死剂量)、Dq值(细胞损伤的准域剂量)、N值(放射损伤修复能力)、SF2(照射2Gy后的细胞存活分数)分别为：2.505、2.804、3.064、0.826及2.184、2.370、2.960、0.772,均小于单纯照射组的3.368、3.993、3.273、0.922,并且药物浓度越大,其数值越小。联合应用西妥昔单抗与塞来昔布后,HT-29细胞的放射敏感性增强,SER (Do)分别为：1.345、1.542；SER (Dq)分别为：1.424、1.685。说明西妥昔单抗与塞来昔布联用能有效减弱HT-29细胞株的放射抗拒性及亚致死性损伤修复的能力,增强其放射敏感性。3流式细胞术实验结果显示：单纯用药组对应于药物浓度(25μg/ml、50μg/ml)诱导HT-29细胞株凋亡率分别为：7.21%、11.74%；单纯照射组的凋亡率对应于照射剂量(2Gy、4Gy、6Gy、8Gy)分别为：10.93%、16.45%、29.84%、39.57%;25μg/ml药物联合附加照射组的凋亡率分别为：17.89%、25.02%、40.32%、48.33%;50μg/ml药物联合附加照射组的凋亡率分别为：22.06%、34.39%、47.57%、54.03%。单纯用药组及低剂量照射组出现了G0/G1期的阻滞现象,而且与用药浓度成正比,具有统计学意义(P<0.05)。当照射剂量为6、8Gy时,S期细胞减少情况明显,具有统计学意义(P<0.05)；在联用药物50μg/ml附加照射8Gy组中,S期达到了最低值11.78%。当照射剂量为4、6、8Gy时G2/M期阻滞明显,具有统计学意义(P<0.05)；在联用药物50μg/ml附加照射8Gy组中,G2/M期达到了最高值27.63%。4Western Blot法检测结果显示：单纯照射组、联用药物附加照射组Caspase-3的蛋白表达量均高于空白对照组,具有统计学意义(P<0.05)；联用药物附加照射组的表达量高于单纯照射组,具有统计学意义(P<0.05)；高浓度药物组的表达量与低浓度组有明显差异,药物浓度与表达量成正比,具有统计学意义(P<0.05)。结论：1在本实验设计的药物浓度范围内,西妥昔单抗联合塞来昔布能有效抑制人结直肠腺癌HT-29细胞株的增殖,且抑制率与药物浓度呈正比。2人结直肠腺癌HT-29细胞株克隆形成率与照射剂量呈反比,在等量照射剂量下,药物附加照射组的克隆形成率明显低于单纯照射组,且存活分数与药物浓度呈反比,西妥昔单抗联合塞来昔布具有一定的放射增敏效应。3单独应用西妥昔单抗联合塞来昔布低浓度组具有一定的G0/G1期阻滞效应,高浓度的西妥昔单抗联合塞来昔布能够明显的降低HT-29细胞株的S期细胞,增加对放射线敏感的G2/M期细胞,放射增敏效应主要由于明显的G2/M期阻滞现象。4应用西妥昔单抗及塞来昔布经放射线照射后HT-29细胞株的Caspase-3蛋白表达量较等剂量单纯照射时升高,西妥昔单抗联合塞来昔布的放射增敏效应可能与其协同增高Caspase-3蛋白表达有关。