在生物除磷的研究中,人们多侧重于除磷生物类群和生化代谢机理的研究,并试图通过改变工艺和环境条件等以解决除磷系统稳定性与高效性的问题。生物除磷是一个微生物主导的过程,微生物活性的发挥需要依靠其体内基因调控。多聚磷酸盐(poly-P)是微生物与外部环境之间进行磷迁移转化的关键,而与其密切相关的调控基因是ppk基因。然而,关于生物聚磷现象的基因调控机制的相关研究还很少,已有的报道也存在各种矛盾。本研究以代谢工程理论为指导,运用“Red同源重组”技术敲除大肠杆菌ppk基因构建ppk基因缺失工程菌,并对其在不同条件下的生物学特性进行研究,旨在探明ppk基因的生物学功能。通过研究,得到以下结果:1.针对p KD4质粒和大肠杆菌ppk基因的上游和下游序列设计引物F-kan/R-kan,以p KD4质粒为模板,探索出扩增条件为:94℃预变性1min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸2min,30个循环;72℃再延伸10min下可成功扩增得到外源线性靶基因片段,片段长度为1613bp。2.当L-阿拉伯糖浓度为15mmol/L时,可诱导p KD46质粒表达Exo、Beta、Gam重组酶;在电击电压为1.8kv时可将外源线性靶基因片段导入目标菌菌体内并在重组酶作用下成功替换ppk基因。3.为避免假阳性现象影响工程菌的筛选,设计正向引物purn-F/ppx-R和反向引物p-F/p-R对工程菌的构建进行检验。正向引物PCR扩增后的结果显示野生菌、重组菌和工程菌可分别获得2464bps、2012bps和635bps的扩增产物;反向引物PCR扩增后的结果显示野生菌可获得约为1200bps的扩增产物,而重组菌和工程菌因基因替换或删除而无法获得扩增产物。通过序列分析可以断定ppk基因缺失工程菌已成功构建并在操作位点上未留下任何抗性基因的选择性标志。4.与野生菌相比,ppk基因的缺失并未影响工程菌的稳定传代和细胞形态。5.ppk基因的缺失可能引起Rpo S蛋白或者Ibe R蛋白表达受限,影响工程菌在培养初期能量物质的合成与贮存,致使在生长稳定期之前,野生菌和工程菌的生长状况没有明显差异,而当进入稳定期后工程菌较野生菌生长劣势。从聚磷角度分析工程菌相对野生菌并未因ppk基因的缺失而影响其聚磷性能。论文认为其他基因可能代偿该基因的部分功能,致使以不同的方式保证其能量代谢的稳定性。生物摄磷现象是一个由多个基因共同调控的复杂的过程。