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课题组前期从富含Na+的强碱性造纸黑液中分离得到一株优势存在的中度嗜盐嗜碱菌Halomonas sp.Y2,进化分析与全基因组测序表明其与Halomonas elongata DSM 2581T菌株的亲缘关系最近,环状染色体大小为3,933,432 bp,GC含量为60.2%,并且基因组注释有丰富的Na+(Li+,K+)/H+逆向转运蛋白系统和相容性溶质基因。Halomonas sp.Y2可通过发达的离子转运体系外排阳离子降低对细胞的毒害作用并维持胞内的pH稳态,对孢子形成萌发等生命活动发挥重要作用。Halomonas sp.Y2菌株独特的耐盐碱特性,具有开发为底盘细胞、并利用海水进行工业发酵生产的巨大潜力,因此对Halomonas sp.Y2菌株离子转运系统的深入研究将为Y2菌株的实际应用提供理论依据。本论文仅对离子转运系统中具有72%的序列一致性,但是在转运活性以及耐盐碱性上存在很大的差异的两种NhaD型Na+(Li+)/H+逆向转运蛋白NhaD1和NhaD2进行研究。课题组前期构建的若干NhaD1与NhaD2的C端与N端相互替换的嵌合体N39D2,N39D1,NhaD2ΔC4,NhaD1-C4 的 Na+(Li+)/H+转运活性完全丧失。但是以N39D2为模板,在其C端添加NhaD2的C末端4个氨基酸或7个氨基酸序列构建的嵌合体N39D2-C4,N39D2-C7,恢复了部分转运活性与生长互补能力。在此结果上通过软件预测结合碱性磷酸酶实验进一步分析NhaD1与NhaD2蛋白的拓扑结构,通过荧光共振能量转移(FRET)分析NhaD1与NhaD2蛋白的C端与N端的的功能作用。结果发现:软件预测结合碱性磷酸酶验证表明NhaD1与NhaD2的C端与N端都是非常不保守的,与V.Cholera中的D型转运蛋白的分析结果Nout-Cin相反,跨膜区域分布为Nin-Cout。同时FRET结果表明在NhaD2的N端39位点和C端融合的荧光供体和受体间可发生荧光共振能量转移,说明NhaD2的N端和C端距离相对较近,在10 nm以内,两者在转运活性和生长互补功能上相互依赖,共同发挥作用。并且NhaD1与NhaD2和N39D2-C7嵌合体的N端保守的38位点的氨基酸Glu38和Pro38相互突变后转运能力降低或完全丧失,说明酸性氨基酸Glu38和Pro38也是N端重要的位点之一,在各自位置上发挥重要作用,不可相互替换。进一步,基于课题组前期构建的一系列NhaD1及NhaD2的嵌合体的研究,N463rD2-C7嵌合体仅能耐受300 mM NaCl,在此条件下呈现微弱生长,与原始NhaD2耐受性相差较大,说明NhaD2的463-485区域是影响菌株耐受性生长的关键区域。为研究影响NhaD1及NhaD2互补生长及转运活性pH依赖性的关键区域与位点,对NhaD2的TM ⅩⅢ跨膜螺旋进行了进一步的研究。结果发现:通过NhaD1与NhaD2的序列比对发现463-485区域中存在7个不同的氨基酸位点,NhaD2 中的 V466,A468,V474,A478,A479,M482,1483,分别对应NhaD1 中的 A466,V468,1474,1478,V479,W482,L483,并且都为非极性疏水氨基酸。通过重组PCR对N463rD2-C7的7个位点进行逐步定点突变,每一个突变以前一个突变体为模板,最后全部突变为NhaD2的序列。结果表明TMⅩⅢ的7个氨基酸全部突变为NhaD2相应的氨基酸以后转运活性与生长互补完全恢复,但这个过程不是规律的逐步的恢复,特别是在468位点和482位点处存在因转录水平的明显下调导致的转运活性和生长互补能力的显著降低。回补Y2/ΔnhaD2菌株同样得到相同的结果,7位点全部突变后回补Y2/ΔnhaD2的能力与NhaD2相同。结合NhaD2与N463r的39位点或420位点与C端的FRET实验,发现N463r嵌合体与原始NhaD2蛋白相比构象发生了改变,从而验证了TM ⅩⅢ在离子运输活动和NhaD2的离子通道和生理功能上的重要作用。最后,通过NhaD2与Ec-NhaA,Vc-INDY等转运蛋白的进化保守性比较分析与其类似的核心区域,即NhaD2中两个非常保守的区域TM Ⅳ-Ⅵ和TMⅩ-Ⅻ,并选择20个可能具有感应pH变化能力的保守氨基酸,对其进行定点突变,共成功构建了 30个突变体。经过转运活性验证和生长互补验证以及敲除NhaD2基因的Y2菌株的回补实验,并结合已有晶体结构的Vc-INDY,E.coli NhaA转运蛋白和其它类似蛋白中的离子结合位点的分布与氨基酸特点,进一步确定了 NhaD2中与离子结合有关的的关键区域和位点,分析NhaD2蛋白中重要的氨基酸位点D166,N167,D405,N406可能位于由核心区域TM Ⅳ-Ⅵ和TMⅩ-Ⅻ形成的类似漏斗通道的底部,直接或间接参与底物转运过程。并且,T170突变为Ser后,NhaD2的表观Km值增大了 10-15倍,分析T170为影响底物与蛋白结合的氨基酸位点。