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银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract,Gb E)是从银杏树的干燥叶中提取纯化而成的一种淡黄色粉状物质,化学成分复杂,黄酮醇苷和萜类内酯是其主要活性成分。临床上广泛用于心脑血管疾病和中枢神经系统疾病如阿尔茨海默症、眩晕和耳鸣的预防和治疗,市场前景广阔。然而,黄酮醇苷成分水溶性和脂溶性差,口服具有首过效应且难以跨过血脑屏障,因此Gb E普通制剂口服生物利用度低,在脑部分布少,临床疗效大大降低。为了提高Gb E的口服生物利用度和在脑组织中的分布,本文制备了一种新型的含胆汁盐的前体脂质体给药系统用于口服递送Gb E,并对其体内外特征和肠吸收机理进行了研究。主要研究内容如下:一、P-Gb E体外分析方法的建立。本文采用高效液相色谱法建立了Gb E前体脂质体(Gb E proliposomes,P-Gb E)中三种黄酮醇苷(槲皮素、山柰素和异鼠李素)和四种萜类内酯(白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C)的体外含量测定方法,并进行了方法学验证,结果显示各项指标均符合相关要求。同时建立了超速离心法测定P-Gb E复溶后所得Gb E脂质体包封率的方法。该方法操作简单、快速、重现性好,可以有效分离Gb E脂质体复溶液中的游离药物。二、P-Gb E的制备和处方优化。本文采用改良的乙醇注入法结合喷雾干燥法成功制备了P-Gb E。该制备方法操作简便,省时省力,成本较低,易于工业化放大。采用单因素实验方法分别考察了处方浓度、蛋黄卵磷脂(Egg yolk lecithin,e PC)投料量、脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate,Na DC)投料量、载体种类和载体投料量对P-Gb E复溶后所得脂质体的粒径、粒度分布、黄酮醇苷包封率和萜类内酯包封率等指标的影响,确定了黄酮醇苷包封率是评价P-Gb E的最重要指标,e PC投料量、Na DC投料量和载体甘露醇投料量是影响黄酮醇苷包封率的三个显著因素。在单因素实验的基础上,以黄酮醇苷包封率为考察指标,采用Box-Behnken设计和响应面法对P-Gb E的处方进行优化,确定了最优处方为Gb E 200 mg、e PC 225mg、Na DC 67mg和甘露醇735mg。三、P-Gb E的质量评价。本文对最优处方制备的P-Gb E的外观形态、粒径、粒度分布、表面电位、包封率、体外释放度、体外溶出度、固态特征、初步稳定性和初步安全性进行了评价。P-Gb E为浅黄色粉末,略有一定的腥臭味。场发射扫描电镜观察其形态,大多为球形。P-Gb E复溶后所得Gb E脂质体的粒径为211.7±5.4 nm,PDI值为0.197±0.012,zeta电位为-27.7±5.5 m V。黄酮醇苷包封率和萜类内酯包封率分别为91.48%±0.77%和96.18%±0.55%。体外释放结果表明,P-Gb E复溶所得的脂质体具有一定的迟释或缓释作用,释药具有p H依赖性,释药行为符合Korsmeyer-Peppas模型,以Fick扩散为主。体外溶出结果表明,前体脂质体可以明显增强Gb E在肠道(p H 6.8)中的溶出度。差示扫描量热法和傅里叶变换红外光谱法的结果表明,在前体脂质体的制备过程中,Gb E与其他辅料e PC、Na DC和甘露醇不是简单的物理混合,而是形成了新的物相,并产生了一些较弱的相互作用,如氢键、范德华力等。恒温加速实验结果表明,P-Gb E在温度40℃及相对湿度75%条件下,具有良好的贮存稳定性。小鼠急性毒性实验结果表明,P-Gb E具有良好的安全性。四、P-Gb E生物样品分析方法的建立本文建立了一种快速、灵敏和准确的同时测定生物样品(大鼠血浆,大鼠肝、肾、脾、心、肺和脑六种组织以及大鼠肠灌流液)中槲皮素、山柰素、异鼠李素、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的超高效液相色谱-串联质谱(Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometer,UPLC-MS/MS)方法。以花旗松素为内标,采用液-液萃取法对生物样品中七种待测成分进行提取,经Waters BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm)色谱分离后注入三重四极杆串联质谱仪进行检测。质谱检测系统采用电喷雾离子(Electronic spray ion,ESI)源,正离子检测方式,在多反应监测(Multiple reaction monitoring,MRM)模式下检测七种成分和内标。根据FDA和SFDA的相关规定,对大鼠血浆,大鼠肝、肾、脾、心、肺和脑六种组织以及大鼠肠灌流液的分析方法进行完整的方法学验证,对专属性、线性、最低定量限(Lower limit of quantification,LLOQ)、精密度、准确度、基质效应、提取回收率以及稳定性进行了考察,结果显示各项指标均符合相关要求。五、P-Gb E的药代动力学研究。通过建立的同时测定大鼠血浆中槲皮素、山柰素、异鼠李素、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的UPLC-MS/MS方法,对P-Gb E的大鼠药代动力学特征进行了研究。与Gb E相比,除白果内酯外,P-Gb E中其他六种成分的Cmax、Tmax、T1/2、AUC0–∞和MRT0–∞均显著增大(P<0.05),P-Gb E中槲皮素、山柰素、异鼠李素、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的相对生物利用度(P-Gb E的AUC0–∞与Gb E的比值)分别为2.45、2.11、2.64、2.03、3.33和2.94,表明前体脂质体具有降低Gb E在胃肠道的吸收速率、延长其血液循环时间,提高其口服生物利用度的作用。六、P-Gb E的组织分布研究。通过建立的同时测定大鼠肝、肾、脾、心、肺和脑六种组织中槲皮素、山柰素、异鼠李素、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的UPLC-MS/MS方法,对P-Gb E的大鼠体内组织分布特征进行了研究。除肾以外,P-Gb E中七种成分大多数分布于网状内皮系统丰富的肝、脾和肺组织中。与Gb E相比,P-Gb E中七种成分在肝、脾、心、肺和脑中的药时曲线下面积(AUC)显著增大(P<0.05),在肾中的AUC显著减小(P<0.001),表明前体脂质体显著提高了Gb E在肝、脾、心、肺和脑组织中的分布。P-Gb E中三种黄酮醇苷成分的相对摄取率(P-Gb E的AUC与Gb E的比值)从大到小依次是脑、肺、脾、心、肝和肾,四种萜类内酯成分的相对摄取率从大到小依次是脑、肺、心、脾、肝和肾,显示前体脂质体具有一定的脑、肺组织靶向性,表明前体脂质体具有跨血脑屏障的能力。七、P-Gb E肠吸收机理的研究。通过建立的同时测定大鼠肠灌流液中槲皮素、山柰素、异鼠李素、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的UPLC-MS/MS方法,采用大鼠在体单向肠灌流模型对P-Gb E的肠吸收机理进行了研究。在十二指肠、空肠、回肠和结肠四个肠段中,除白果内酯外,P-Gb E中其他六种成分的吸收速率常数(Absorption rate constant,Ka)和表观渗透系数(Apparent permeability coefficient,Papp)均显著大于Gb E(P<0.05),P-Gb E中槲皮素等七种成分的Ka值大小顺序是十二指肠>回肠>空肠>结肠,表明前体脂质体可以显著提高Gb E在肠道的吸收,主要吸收部位为十二指肠和回肠。综上所述,将Gb E制备成前体脂质体后,其口服生物利用度、体内靶向性和跨血脑屏障能力均得到了显著改善。因此,作为一种新型口服给药系统,含胆汁盐的前体脂质体剂型是提高难溶性药物口服生物利用度和跨血脑屏障能力的有效方法,同时本研究也为临床应用提供了一定的理论基础。