本研究利用中国地方小麦作为研究材料,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及双向电泳鉴定其Waxy蛋白亚基组成,并结合特异性分子标记进行验证。发现3份材料分子标记检测结果与蛋白电泳结果矛盾,我们推测该基因可能具有新的结构变异。选取其中1份材料“小白皮”进行Wx-B1蛋白缺失的分子机制研究,通过PCR扩增与Genome Walking(基因组步移)等方法相结合,成功获得了涵盖编码区和3’-非编码区9160bp的完整Wx-B1基因序列,揭示了其沉默的分子机制,并开发了特异性检测该变异类型的分子标记。主要结果如下:1.利用Wx-1等位基因特异性分子标记,对本实验室前期研究中,通过SDS-PAGE检测出的10份Waxy蛋白亚基缺失的中国地方小麦材料(其中Wx-A1和Wx-B1蛋白亚基材料分别为4份和6份)进行基因型检测。结果表明,4份Wx-A1亚基缺失材料和3份Wx-B1亚基缺失材料的基因型为Wx-A1b和Wx-B1b;3份材料(小白皮、毛红麦、有芒洋麦)的分子标记鉴定结果显示其Wx-B1基因带型与中国春(Wx-B1a,蛋白正常表达类型)的相同,分子标记检测结果与蛋白电泳结果矛盾。利用双向电泳对这3份材料进行再鉴定,确定其Wx-B1蛋白亚基未表达,推测该基因可能具有新的结构变异。2.对中国地方小麦品种小白皮Wx-B1基因进行克隆,获得了包含Wx-B1编码区和3’-非编码区共9160bp的片段。发现在其开放阅读框(ORF)的第十外显子(2462bp)处插入了一个2178bp的大片段,导致Wx-B1蛋白亚基缺失。根据国际命名法,我们将这个基因命名为Wx-B1n。3.对Wx-B1n中的插入序列分析表明,插入片段具有反向重复和正向重复元件,是典型的转座子结构特征,因此,插入Wx-B1n的2178bp的DNA片段为转座子。将转座子序列与NCBI、中国春基因组数据库进行比对,表明“小白皮”中的转座子序列来源于3B染色体。进一步验证结果显示,该片段是从3B染色体移动到当前位置而不是复制到Wx-B1编码区中的,属于非复制转座子。4.Wx-B1n基因沉默机制不同于Wx-B1b、Wx-B1k和Wx-B1m等已知的Wx-B1沉默等位基因。Wx-B1b基因沉默是由于缺失了包含Wx-B1基因编码区在内的长约67kb的序列,Wx-B1n等位基因是转座子插入导致的基因沉默,因此保留了这67kb的序列。据我们所知,这种结构突变从未在Wx-B1等位基因中报道。此外,Wx-B1b基因缺失的区域中可能存在一些基因,这些基因中能在胚乳中表达,并可能与淀粉合成相关。