研究背景与目的： 细胞基因组DNA随时遭受DNA损伤的侵袭，其中引起细胞内DNA损伤的因素主要包括内源性因素和外源性因素，其中内源性因素有：复制错误；随机碱基损伤(脱氨基作用、脱嘌呤作用)；代谢产物(氧自由基等因素引起的碱基氧化、甲基化、水解、错配等)。外源性因素有：化学性的(化学诱变剂碱基类似物5-BU、羟氨类(NH20H)、亚硝酸盐(NO2)、烷化剂如氮芥类等)；物理性的(紫外线、γ射线等)。面对种类繁多、数目巨大的DNA损伤，细胞拥有完善的DNA损伤应答机制，细胞会启动各种损伤修复机制或凋亡途径，使细胞DNA损伤得到修复，或使无法修复的细胞选择凋亡。如果细胞的损伤修复机制或凋亡系统失常，即DNA损伤得不到正确修复或不能凋亡，细胞基因组DNA将大量积累突变，乃至染色体畸变，导致DNA高突变型细胞的产生，最终导致癌基因的激活，原癌基因的失活，细胞由高突变表型变成肿瘤表型。 针对不同的损伤机制可采用不同的损伤修复机制，如随机碱基损伤可采用碱基切除修复、碱基甲基化可采用直接修复、紫外线导致的DNA损伤可采用核苷酸切除修复等。在众多的DNA损伤修复机制中，近年来在生物细胞中发现了一种由Y家族DNA聚合酶介导的跨损伤复制机制。Y家族DNA聚合酶对DNA损伤引起的空间结构的扭曲高度耐受，能以损伤的DNA为模板进行复制，以保证DNA复制的正常进行，帮助带有损伤DNA的细胞度过难关不致死亡。但是Y家族DNA聚合酶可不依据严格的碱基互补配对原则同时缺乏缺乏3’-5’核酸外切酶活性，因此没有错配碱基的校正阅读功能，所以复制DNA时有很高的碱基错配倾向[1-3]，故又称为错配倾向聚合酶。Polι属于Y家族的DNA聚合酶之一，体外研究初步阐明了Polι DNA复制保真性很低，是目前发现的保真性最低的聚合酶，其保真性较高保真聚合酶低1000-10000倍：同时主要的生物学功能为实施某些DNA损伤后的跨损伤复制。但是其体内的生物学功能尚不清楚，本课题组以前的工作发现在乳腺癌细胞中Polι过度表达，并可能参与了乳腺癌细胞中基因组高突变型的形成。同时首次发现并成功克隆了Polι的同源异构体，由于该异构体比Polι少第5个外显子，故命名为Polιs5，但Polιs5的功能尚不得知。为了进一步研究Polι及Polιs5体内的生物学功能，以及跨损伤复制在遗传不稳定性产生中的作用，我们将构建稳定高表达Polι或Polιs5的HEK-293细胞系，采用紫外线(UVC，256nm)DNA损伤，利用激光共聚焦技术，通过对比Polι及Polιs5在UV损伤前后的细胞定位改变，观察Polι及Polιs5是否在DNA损伤后聚集到复制叉上，证实Polι及Polιs5参与体内DNA损伤后跨损伤复制过程；进一步，通过MTT法、体内突变检测系统，研究Polι及Polιs5介导的跨损伤复制的生物学功能。 方法： 1、HEK-293稳定高表达Polι(Polι-HEK-293)或Polιs5(pohs5-HEK-293)细胞系的建立。pcDNA3.1-Polι和pcDNA3.1-Polιs5由本实验室保存。利用氯化钙法将两个质粒分别转化入DH5α大肠杆菌，经过质粒小抽，初步鉴定后，进行测序，将测序结果利用生物信息技术BLAT(www.genome.ucsc.edu)进行鉴定。以证明pcDNA3.1-Polιs5的目的片段Polιs5比pcDNA3.1-Polι的目的片段Polι少Polι的第5外显子，为我们进一步对Polι与Polιs5的功能对比研究奠定基础。HEK-293细胞经胰酶消化后，接种到35mm培养皿中，参照LipofectamineTM2000脂质体操作说明，将lipofectamine2000- DNA复合物加入培养板中，37℃，5％CO2培养4小时后，换入含有血清的DMEM培养基，生长24小时后，传代致六孔板中，再培养48小时后，将培养基换为含有600ug/mlG418的培养基进行稳定筛选。筛选出的抗G418的克隆经RT-PCR检测选出高表达目的基因的细胞克隆。 2、Polι与Polιs5细胞定位研究。通过用激光共聚焦显微镜检测细胞在受到紫外线UVC照射后Polι及Polιs5在细胞核分布的改变分析其功能差异。培养HEK293细胞，利用阳离子脂质体瞬时转染的方法，将质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5分别转染HEK293细胞，36小时后，用紫外线UVC(15J/m2)照射使细胞DNA损伤，4小时后用激光共聚焦显微镜观察在质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5分别瞬时转染的HEK293细胞，细胞内绿色荧光蛋白在紫外线照射前后分布的改变。 3、Polι与Polιs5对紫外损伤耐受的功能对比研究。HEK-293、Polι-HEK-293和Polιs5-HEK-293用胰酶消化后，按8000个/孔铺板于96孔板中，第二天细胞贴壁后，将培养基吸干，用不同剂量的紫外线照射细胞，加入培养基继续培养，24小时或72小时后用MTT法检测细胞生存率。 4、Polι与Polιs5介导UV损伤后基因突变发生的对比研究。分别用1500 J/m2，3000J/m2的紫外剂量照射pSupFG1质粒后，将其分别转染入HEK-293、Polι-HEK-293和Polιs5-HEK-293细胞培养48小时后；提取细胞内的supF质粒，用Dpn I酶切三个小时，然后将其电转入SY204细菌；将细菌铺板在含有X-gal、IPTG和氨苄青霉素的平板上，长出蓝白斑，数蓝白斑数量计算突变频率；挑出白斑摇菌送往上海生工公司测序，统计突变频谱。 结果： 1、成功将质粒pcDNA3.1-Polι和pcDNA3.1-Polιs5转化DH5α大肠杆菌，并进行质粒小抽，初步鉴定后将质粒进行测序，将测序结果利用生物信息技术BLAT(www.genome.ucsc.edu)证明：pcDNA3.1-Polιs5的目的片段Polιs5比pcDNA3.1-Polι的目的片段Polι少Polι的第5外显子，为我们进一步对Polι与Polιs5的功能对比研究奠定了基础。我们通过脂质体转染法成功将我们的质粒转入HEK-293细胞，通过G418筛选，最终获得抗G418抗性的细胞克隆。通过Tripure分离提取细胞总RNA，电泳结果显示：18S和28S条带显示清晰，28S条带的强度约为18S条带的2倍，5S条带极弱，未见DNA污染条带出现，表明所提取的RNA完整性好，纯度可靠.可以满足RT-PCR实验的要求。通过RT-PCR初步检测结果表明：在具有G418抗性的HEK-293细胞中，检测到Polι、Polιs5表达量增加的细胞克隆，其表达量高于未转染HEK-293细胞。 2、通过质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5瞬时转染HEK293细胞48小时后，激光共聚焦检测，结果显示质粒转染率高，在正常条件下，对照EGFP蛋白均匀分布于细胞浆与细胞核内，Polι及Polιs5则大多均匀分布于细胞核，为核蛋白。在UV(15J/m2)照射4小时后，对照EGFP蛋白仍均匀分布于细胞浆与细胞核内；Polι及Polιs5则均出现细胞核内局部荧光聚集现象，形成复制镜像，证实Polιs5与Polι参与紫外线UVC导致的DNA损伤的跨损伤复制过程。 3、用不同剂量的紫外线照射细胞后24小时，用MTT法测细胞存活率。HEK-293细胞存活率由100％下降到72％；稳定高表达Polι-HEK-293细胞存活率由100％下降到76％；稳定高表达Polιs5的Polιs5-HEK-293细胞存活率由100％下降到82％；经过统计学分析三者之间没有明显差异。 用不同剂量的紫外线照射细胞后72小时，用MTT法测细胞存活率。HEK-293细胞存活率由100％下降到16％； Polι-HEK-293细胞存活率由100％下降到12％；Polιs5-HEK-293细胞存活率由100％下降到14％；经过统计学分析三者之间没有明显差异。 4、我们将pSupFG1质粒成功转入HEK-293、Polι-HEK-293、Polιs5-HEK-293，并提取出细胞内PsupFGl质粒，然后高效的将其转入SY204细菌，最后铺板数出蓝白斑得出突变频率，通过挑白斑摇菌测序得出突变频谱。结果显示Polι或Polιs5在细胞内的过度表达将导致DNA损伤后诱发高突变的产生，并具有一定的突变特征。 结论： 1.成功构建了稳定Polι或Polιs5高表达的细胞模型，为进一步研究Polι和Polιs5的体内生物学功能奠定基础。 2.证实Polι和Polιs5能参与细胞紫外损伤后的细胞应答过程。 3.Polι和Polιs5对紫外线损伤后的细胞的生存没有影响。 4.Polι和Polιs5参与介导体内紫外线DNA损伤诱发高突变的产生，并具有一定的突变特征。 5.PolιS5作为Polι的剪切异构体与Polι具有相似的功能。