甜菜夜蛾端粒DNA鉴定、端粒酶活性测定及其TERT基因克隆

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本文通过观察实验中的有趣现象引申出了一个科学问题:为什么甜菜夜蛾脂肪体组织原代细胞比棉铃虫和斜纹夜蛾细胞均容易成系?通过查阅文献资料,认为甜菜夜蛾脂肪体组织中可能有高活性的端粒酶表达。设计了实验对这3个物种的中肠和脂肪体组织,以及来自甜菜夜蛾脂肪体组织的细胞系IOZCAS-SpexⅡ-A的端粒酶活性进行了TRAP实验检测。实验结果证实了假设,在甜菜夜蛾脂肪体和中肠组织,及其细胞系IOZCAS-SpexⅡ-A中均检测到了较高活性的端粒酶表达,而其它两个物种(棉铃虫和斜纹夜蛾)的TRAP产物凝胶图谱显示,其组织中表达的端粒酶活性不完整,或者没有持续合成能力。通过对TRAP实验产物的测序分析,确认了甜菜夜蛾的端粒片段采用的是昆虫界普遍采用的(TTAGG)n的5核苷酸重复序列。我们通过设计保守序列简并引物的方法,扩增IOZCAS-SpexⅡ-A细胞系中端粒酶蛋白mRNA部分序列,然后采用5-&3-RACE扩增全长片段。成功地得到了甜菜夜蛾的端粒酶催化基团(TERT)基因,并命名为SpexTERT,提交到NCBI/EMBL/DDBJ数据库(AccessionNumber:KC347571)。对SpexTERT进行生物信息学分析,发现在已知物种的端粒酶序列中,它和家蚕最接近,相似性达到48%。SpexTERT的mRNA长度为2278 bp,编码一个由708个氨基酸组成的蛋白质—甜菜夜蛾端粒酶催化基团,这个基因没有内含子和GQ基团。这挑战了之前有关GQ基团的缺失是导致家蚕BmoTERT基因不能检测到端粒酶活性的原因。  为了能够在重组体外验证端粒酶活性,以及为全部采用(TTAGG)n这种5核苷酸端粒重复模式的物种,提供一种快速建立细胞系的办法,需要获取甜菜夜蛾端粒酶RNA组分的序列信息。于是设计了包括纯化、逆转录等一系列的实验,来扩增甜菜夜蛾端粒酶RNA组分。到目前为止,未能成功扩增出目的片段,可能的原因有:一方面是因为端粒酶RNA组分序列保守性很低,另外一方面可能是因为在RNA-DNA连接步骤时间过久(10h),或者去RNase条件不严格的情况下,RNA发生了降解。  通过总结和大量文献的查阅,发现了一个潜在的新的结构与功能相适应理论证据并提出模型即:TERT基因N端保守基团、端粒结合蛋白与端粒G-四聚体形成之间有协同关系。  
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