论文部分内容阅读
背景:银屑病是一种慢性复发性炎症性皮肤病,受遗传和各种环境因素的影响。银屑病的病理特征是角质形成细胞异常增殖分化、表皮中性粒细胞浸润形成微脓肿以及真皮以T细胞为主的免疫细胞浸润。银屑病的发病机制复杂,虽然目前仍有争议,但普遍认为激活的角质形成细胞和浸润的免疫细胞之间的复杂相互作用导致了疾病的发生发展。近年来中性粒细胞在银屑病发病机制中的作用逐渐受到关注,越来越多的证据表明其在银屑病中发挥着至关重要的作用。中性粒细胞是银屑病病变皮肤中最主要的细胞类型之一,其在早期渗入真皮,然后在慢性阶段进入表皮,与角质形成细胞粘附积聚在表皮形成微脓肿是银屑病的典型病理表现之一。由于中性粒细胞的半衰期较短,为了维持银屑病病变的慢性化,需要不断招募中性粒细胞到病变皮肤中。抗中性粒细胞治疗不仅可以减轻咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮炎,对银屑病患者也有良好的疗效。Del-1是一种内源性抗炎因子,其基因缺陷小鼠表现为明显的中性粒细胞浸润和IL-17升高。Del-1发挥哪种功能取决于来源的“细胞类型”,内皮细胞来源的Del-1通过拮抗中性粒细胞的整合素LFA-1,阻断了中性粒细胞与血管内皮细胞粘附分子ICAM-1的相互作用,从而抑制了中性粒细胞与内皮的黏附及随后的跨内皮迁移。巨噬细胞来源的Del-1可以促进组织巨噬细胞对凋亡中性粒细胞的清除,从而促进炎症的消退。然而人皮肤角质形成细胞是否表达Del-1及其具体作用还不清楚。拮抗中性粒细胞向表皮浸润是治疗银屑病的一个很有前景的策略,Del-1作为中性粒细胞的调控因子,可能通过拮抗中性粒细胞向表皮的浸润减轻银屑病的发生发展,值得进一步研究。研究目的:本研究旨在探究银屑病中角质形成细胞来源的Del-1对中性粒细胞向表皮浸润的影响,并探索其影响中性粒细胞趋化和粘附作用的潜在分子机制,为银屑病表皮过度中性粒细胞浸润的机制提供理论依据,同时为银屑病的治疗提供新的潜在靶点。研究方法:1.利用免疫组化对Del-1在寻常型银屑病患者表皮中的表达情况进行定位与半定量,并通过分离患者病变皮肤和健康人皮肤的表皮,采用RT-q PCR检测Del-1在患者表皮中表达情况。利用GEO数据库数据分析Del-1在寻常型银屑病患者皮损中的表达情况及其与IL-17A的相关性,并通过RT-q PCR在患者皮损中进行验证。利用RT-q PCR及Western Blot在银屑病细胞模型中检测Del-1的表达情况。2.利用过表达慢病毒及sh RNA慢病毒构建稳定过表达及敲低Del-1的Ha Ca T细胞株。分离健康人外周血中性粒细胞,并用celltracker红色荧光染料标记中性粒细胞。用TNF-α刺激Ha Ca T细胞模拟银屑病细胞模型。实验分为四组:正常Ha Ca T细胞（Ctrl组）作为阴性对照、TNF-α刺激Ha Ca T细胞模拟银屑病细胞模型（Ctrl+TNF-α组）作为阳性对照、TNF-α刺激过表达Del-1的Ha Ca T细胞（OE-Del-1+TNF-α组）及TNF-α刺激敲低Del-1的Ha Ca T细胞（sh-Del-1+TNF-α组）作为实验组。分别收集600ul不同组细胞培养上清,置于Transwell装置的下层孔板中,将100ul红色荧光标记的中性粒细胞悬液置于Transwell装置的上层小室,于细胞培养箱中孵育1h后,取下上层小室,将Transwell装置下层孔板于荧光显微镜下拍照,带红色荧光的即是趋化到下层的中性粒细胞。同时收集不同组下层孔板中的中性粒细胞进行计数,并统计分析不同组中趋化的中性粒细胞数量。3.96孔板中接种等数量的不同组细胞（Ctrl、Ctrl+TNF-α、OE-Del-1+TNF-α及sh-Del-1+TNF-α组）,待细胞融合度为100%时,将红色荧光标记的中性粒细胞悬液轻柔加入各组单分子细胞层上,置于细胞培养箱中孵育40分钟后取出孔板,弃培养基,PBS轻轻洗涤3次,清洗掉未粘附的中性粒细胞,然后荧光拍照,每孔取上下左右中5个视野,并用Image J计数带红色荧光的中性粒细胞数量,用SPSS软件进行统计分析。4.利用炎症反应与自身免疫PCR阵列筛选上述四组中的差异基因并采用RT-q PCR进行验证。通过RT-q PCR和Western Blot检测四组中粘附分子ICAM-1的表达情况。5.提取上述四组细胞的总蛋白以及核蛋白,通过Western Blot检测四组中NF-κB-P65的磷酸化及核移位情况,探究Del-1调控炎症因子的分子机制。研究结果:1.寻常型银屑病患者皮损和健康人皮肤石蜡组织Del-1的免疫组化提示Del-1在人皮肤角质形成细胞中组成性表达,且在患者表皮中表达降低。收集病理诊断为色素痣、脂溢性角化症等疾病的皮损周围正常组织为健康对照,收集皮肤病理检查留存的病理诊断为寻常型银屑病的冰冻组织为实验组,分离表皮,提取RNA行RT-q PCR检测,结果提示Del-1m RNA在银屑病患者表皮表达水平也是降低的。利用GEO数据库GSE13355数据集测序结果分析,与健康对照皮肤相比,Del-1在银屑病患者病变皮肤中表达降低,RT-q PCR验证与数据库结果一致。在GEO数据库中筛选患者量最大的数据集GSE30999,提取各样本Del-1（即EDIL3）和IL-17A m RNA表达量后进行相关性分析,结果提示Del-1与IL-17A呈中等负相关（r=-0.45）。在TNF-α刺激Ha Ca T细胞模拟的银屑病细胞模型中,Del-1表达水平也明显下调。2.与阴性对照组（Ctrl）相比,TNF-α增强了中性粒细胞向Ha Ca T细胞的趋化作用（Ctrl+TNF-α组）。与Ctrl+TNF-α组相比,过表达Del-1组（OE-Del-1+TNF-α）中性粒细胞向Ha Ca T细胞的趋化作用降低;而敲低Del-1后（sh-Del-1+TNF-α组）,趋化作用又增强了,提示Del-1可以抑制中性粒细胞向Ha Ca T细胞的趋化作用。3.与阴性对照组（Ctrl）相比,TNF-α增强了中性粒细胞与Ha Ca T单细胞分子层的粘附（Ctrl+TNF-α组）。与Ctrl+TNF-α组相比,过表达Del-1组（OE-Del-1+TNF-α）中性粒细胞与Ha Ca T单细胞分子层的粘附作用降低;而敲低Del-1后（sh-Del-1+TNF-α组）,粘附作用又增加了,提示Del-1可以抑制中性粒细胞与Ha Ca T细胞的粘附作用。4.PCR array筛选结果提示,Ctrl+TNF-α组与Ctrl组相比,有48个差异基因,其中上调31个、下调17个。OE-Del-1+TNF-α组与Ctrl+TNF-α组相比,有52个差异基因,其中上调30个、下调22个。sh-Del-1+TNF-α组与Ctrl+TNF-α组相比,有50个差异基因,其中上调42个、下调8个。将Ctrl+TNF-α组上调基因、OE-Del-1+TNF-α组下调基因以及sh-Del-1+TNF-α组上调基因取交集,筛选出6个共同差异基因,分别是CXCL8（即IL-8）、CXCL1、IL-23A、IL-1A、IL-5、C3,从中选择差异倍数明显且与中性粒细胞趋化作用相关的CXCL8进行RT-q PCR验证,证实中性粒细胞最重要的趋化因子CXCL8在过表达Del-1组水平降低,在敲低Del-1组水平升高,差异有统计学意义,提示Del-1可以降低角质形成细胞表达CXCL8。正常Ha Ca T细胞表面粘附分子ICAM-1的表达量较低,在银屑病细胞模型中,TNF-α上调了ICAM-1的表达,过表达Del-1降低了ICAM-1水平,然而敲低Del-1又明显升高了ICAM-1的表达,提示Del-1可以降低角质形成细胞中ICAM-1的表达水平。5.TNF-α可以活化角质形成细胞的NF-κB信号通路,导致NF-κB-P65磷酸化并由胞质进入细胞核内,过表达Del-1组NF-κB-P65的磷酸化水平及核移位均降低;而敲低Del-1组NF-κB-P65磷酸化及核移位均增加,提示Del-1可以抑制NF-κB信号通路。结论:1.Del-1在人皮肤角质形成细胞中组成性表达,且在银屑病患者表皮、皮损、及细胞模型中均下调。炎症因子TNF-α可以降低角质形成细胞表达Del-1的水平,这可能是其导致中性粒细胞浸润的潜在机制。2.Del-1可以减轻银屑病中中性粒细胞向表皮的趋化和粘附作用。3.Del-1可能通过抑制NF-κB活化降低角质形成细胞表达CXCL8和ICAM-1,从而减轻银屑病表皮中性粒细胞的浸润。