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胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,有很高的发病率和病死率,约占成人颅内原发肿瘤的40%-50%。目前临床治疗的原则是以手术切除病变为主,术后辅以放疗和(或)化疗,尽管手术及放化疗有了很大进步,但仍不能从根本上改变这一致命肿瘤的转归。随着肿瘤分子生物学理论及技术的发展,有关脑胶质瘤基因治疗的研究逐渐开展起来。虽然目前基因治疗的方法和策略很多,但都处于实验阶段,一些临床实验的结果也不完全令人满意。目前已经认识到,脑胶质瘤是一种难治性的疾病,其发生机制十分复杂,涉及多因素、多环节。单基因治疗有其自身优势的同时也存在缺陷,因此从单基因向多基因、从单一层次向集成层次、从细胞向整体的研究模式,已经逐渐成为未来肿瘤研究的主导方向,肿瘤的联合基因治疗或综合治疗也逐渐成为研究的趋势。本课题组一直从事脑胶质瘤基因治疗的基础研究。在前期的工作中发现,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在胶质瘤中呈高表达,对胶质瘤细胞的增殖起促进作用,并有可能抑制了胶质瘤细胞的凋亡。同时,通过对HIV-1病毒蛋白R(VPR)的研究也发现,该蛋白具诱导胶质瘤细胞周期G2期停滞和细胞凋亡的活性,在体外具有较明显的抑瘤作用。本研究即在前期研究的基础上,遵循联合基因治疗的设计思路,将在细胞增殖方面起关键作用的bFGF作为靶基因,对其进行RNA干扰,同时将能诱导细胞凋亡的外源性基因HIV-1Vpr导入胶质瘤细胞内,以发挥其诱导细胞凋亡的作用。此种RNA干涉技术与能诱导细胞凋亡的外源性基因转染技术联用的优化方案,从抑制细胞增殖与诱导细胞凋亡两种途径,调控肿瘤细胞的生长代谢,以期达到理想的抑瘤效果,进而总结出一种新的胶质瘤联合基因治疗策略。本课题研究分为以下三个部分：第一部分,通过LR重组法构建携带有bFGF小分子干扰RNA和Vpr基因的重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA和rAd5-Vpr。经PCR鉴定构建成功后,对其进行扩增,并测定病毒滴度均约为2.0×1010GTU/mL或5×108PFU/mL.。第二部分为体外实验,利用第一部分所构建的重组腺病毒,对人脑胶质瘤细胞系U251、LN229、A172进行转染,进行有关细胞增殖和凋亡方面的研究。首先,确定了腺病毒的转染条件,即MOI=50,并通过MTT法研究其对细胞增殖的作用,结果发现rAd5-bFGF-siRNA和rAd5-Vpr均具有抑制胶质瘤细胞增殖的作用,联合治疗效果更加明显；然后,通过流式细胞仪、Hoechst33258染色等方法研究了细胞周期与凋亡的情况,结果显示rAd5-bFGF-siRNA对细胞周期无明显影响,rAd5-Vpr可诱导细胞G2期阻滞,二者均可诱导细胞凋亡,以rAd5-Vpr效果更加明显,二者联用诱导凋亡效果最显著；最后,通过免疫荧光、RT-PCR、Western blot等方法,在不同水平检测了目的基因的表达情况,并通过对相关凋亡蛋白、细胞周期蛋白及信号通路蛋白表达量变化的测定,初步探讨了重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA和rAd5-Vpr诱导细胞凋亡的作用机制。结果显示,bFGF-siRNA组、Vpr组和联合治疗组均可见Bcl-2、Bcl-xL、Cyclin D1蛋白表达降低,Caspase-3及Fas-L蛋白的表达增强,联合治疗组更加明显,说明沉默bFGF基因及导入Vpr基因均可诱导细胞凋亡,且二者联用具有增强的效果；另外,Akt1蛋白各组表达未见明显变化,说明重组腺病毒rAd5-bFGF-siRNA及rAd5-Vpr所诱导的细胞凋亡有可能不是通过影响EGFR-PI3K-Akt/PKB通路实现的；转染了rAd5-bFGF-siRNA各组还可见Stat3蛋白表达降低,提示沉默bFGF基因所导致的细胞凋亡有可能是通过JAK/STAT途径实现的,而单独转染bFGF-siRNA组还可见Bax蛋白表达明显升高,且联合治疗组并未见Bax蛋白表达明显升高,提示Bax的表达可能受bFGF及Vpr基因表达的双重影响,且作用效果不具有明显的协同作用,具体作用机制还有待进一步探讨。第三部分为体内实验。首先建立裸鼠LN229胶质瘤皮下动物模型,并将其分为正常对照组、空载体组、bFGF-siRNA组、Vpr组和联合治疗组,每组6只,分别以PBS, rAd5-bFGF-siRNA、rAd5-Vpr及rAd5-bFGF-siRNA+rAd5-Vpr进行治疗。通过动态观察肿瘤生长情况、HE染色观察细胞形态、免疫组织化学方法检测相关靶蛋白表达的变化、TUNEL法原位检测细胞凋亡及电镜观察细胞超微结构变化等,来研究其在体内对胶质瘤的抑瘤作用及诱导凋亡的效果,进一步验证体外实验的发现。结果显示,rAd5-bFGF-siRNA和rAd5-Vpr在体内均能发挥抑瘤作用,联合治疗效果更加明显,与体外实验结果基本一致。综上所述,可以得出如下结论：沉默bFGF基因及引入Vpr基因在体内外均可抑制脑胶质瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡,且联合应用具有增强效果。