离子交换法纯化重组类人胶原蛋白Ⅱ的研究

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本文利用成本相对低廉的离子交换方法纯化重组类人胶原蛋白Ⅱ(Human-like Collagen Bioprotein Ⅱ,HCB Ⅱ),将菌体经高压匀浆、沉淀、超滤浓缩,得到HCBⅡ的粗品,然后通过离子交换法进一步纯化,获得的HCB Ⅱ达到电泳纯。 通过对6种树脂进行静态筛选,得出阳离子交换树脂CM52对HCB Ⅱ的分离效果最佳。该树脂对HCB Ⅱ有较高的吸附容量和选择性:当pH为4.0缓冲液不加NaCl时,其对HCB Ⅱ的吸附量为54.8mg/g湿树脂,分离因数2.64。 CM52树脂对HCB Ⅱ的吸附平衡研究表明:HCB Ⅱ在CM52上的吸附基本符合Langmuir方程;pH、NaCl浓度对Langmuir方程参数影响较大;pH低于HCB Ⅱ等电点(pI=5.0)时,pH对吸附平衡的影响显著:即在4<pH<5范围内,随着pH增大,吸附容量减小,解离系数K4增大;在3≤pH<4范围内,随着pH增大,吸附容量增大,解离系数K4减小,而pH大于等于5.0时Langmuir方程参数变化不明显;随着NaCl浓度增大,吸附容量减小,解离系数K4增大;温度对Langmuir方程参数的影响较小,温度每升高10℃,吸附容量增加3%左右,解离系数Kd的变化不显著。 以CM52对HCB Ⅱ的吸附平衡数据为基础,优化了CM52对HCB Ⅱ的纯化工艺。通过实验,分别确定了静态吸附和柱层析吸附的操作条件,即静态吸附:在pH4.0、NaCl0.15mol/L、进料浓度为7g/L,处理量为17.26mL/g的条件下吸附60min:柱层析:在pH4.0、NaCl 0.15mol/L、进料浓度5g/L、流速5mL/min的条件下进行吸附。然后上柱,在pH4.0、NaCl 0.30mol/L下进行脱附。实验表明:采用静态吸附的方式吸附HCB Ⅱ,经上柱洗脱后,HCB Ⅱ的吸附量可达到48.6mg/(g树脂),回收率83.8%,操作时间短,分辨率高,最终纯化的HCB Ⅱ达电泳纯,相对分子量为97kD。 对CM52吸附HCB Ⅱ的动力学研究表明:搅拌速度和料液浓度决定了其动力学控制机理。以简单线性推动力模型拟合膜扩散控制(film diffusion control,FDC)时的动力学数据,其线性关系良好,模型准确度较高;对于颗粒扩散控制(particle diffusion control,PDC)的吸附,则以粒内表面扩散控制模型拟合,求出表面扩散系数,模型较好的描述了CM52对HCB Ⅱ的PDC吸附。同时,考察了搅拌速度、溶液浓度和温度对FDC模型参数的影响以及溶液浓度和温度对PDC模型参数的影响。
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