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目的:1.临床部分:应用单臂研究的方法,观察EGFR 19外显子缺失突变/21外显子L858R点突变的ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌病人经一线TKI治疗后缓慢进展,持续原TKI治疗联合榄香烯乳注射液静脉滴注的中位PFS,探讨榄香烯乳注射液是否能逆转TKI耐药,延长患者生存时间,为临床上靶向治疗后耐药患者的后续治疗提供新的可能的治疗选择。2.实验部分:通过检测榄香烯乳注射液对人肺腺癌细胞株HCC827细胞和A549细胞增殖、周期的影响以及对c-metmRNA表达和p-met、met、EZH2、p-Akt、Akt蛋白表达的影响,探讨β-榄香烯发挥抗肿瘤作用的通路,研究β-榄香烯与TKI耐药相关的分子机制,以期发挥中医药的优势弥补目前靶向治疗的不足。方法:1.临床方面:采用单臂研究的方法,纳入存在EGFR19外显子缺失突变或21外显子L858R点突变并经第一代TKI(包括吉非替尼、厄洛替尼和埃克替尼)治疗后缓慢进展的ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌患者(缓慢进展的标准为:疾病控制≥6个月;与以往评估相比,肿瘤负荷轻微增加(=2分);症状评分≤1分),治疗措施为持续吉非替尼250mg/天口服或厄洛替尼150mg/口服或埃克替尼125mg/天口服+榄香烯乳注射液400mg溶入5%葡萄糖注射液400ml中静脉滴注,每日一次,连用14天,休息14天,每28天为一个周期,每1周期治疗后检测血常规、肝肾功能和相关肿瘤标志物,每两周期行1次影像学检查进行疗效评估,并详细观察记录患者的症状改变,做好全面的数据收集、输入以及统计分析,直到影像学检查提示肿瘤再次进展,临床医生判断药物治疗无效,观察榄香烯乳注射液联合EGFR-TKIs的中位PFS、患者的生活质量以及其安全性。2.实验方面:以人肺腺癌细胞株HCC827细胞和A549细胞为研究对象,用不同浓度的榄香烯乳注射液作用相应的时间,并设置空白对照组,利用MTT法检测药物对肺癌细胞增殖的影响,利用流式细胞仪检测药物对肺癌细胞周期的影响,通过Western Blot技术检测上述药物处理后细胞株p-met、met、EZH2、p-Akt、Akt蛋白的表达,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测上述细胞株c-met mRNA的水平。结果:1.临床部分:(1)从2015年5月至2017年4月,纳入的20例病人中,作意图治疗分析(ITT分析)的有19例,因1例患者发生药物相关不良事件提前中止研究,最终作遵从研究方案受试者分析(PPA分析)的有19例,其中位PFS为3.1个月(95%CI:2.60,3.54);对其按EGFR基因突变状态进行分组分析,EGFR 19外显子缺失突变的有11例,其中位PFS为3.07个月(95%CI:1.50,4.65);EGFR21外显子L858R点突变的有9例,其中位PFS为2.67个月(95%CI:1.74,3.60);对其按所服用的TKI药物进行分组分析,服用易瑞沙的有13例,其中位PFS为2.83个月(95%CI:2.13,3.54);服用特罗凯的有5例,其中位PFS为2个月(95%CI:1.79,2.22),服用埃克替尼的有2例,因病例数太少,无法进行生存分析。在20例病人中,有18例病人达到观察终点—肿瘤再次进展或死亡,在这18例病人中,有1例死亡,有1例表现为靶病灶进展并出现新发病灶,另外16例病人均表现为出现新发病灶。(2)比较联合榄香烯乳注射液前后患者的生活质量得分情况(采用FACT-L生活质量评分表进行评估),发现纳入PPA分析的所有病人在TKI联合榄香烯乳注射液治疗期间生活质量较好,较之使用榄香烯乳注射液前未见生活质量的下降(P>0.05)。(3)TKI耐药后继续TKI联合榄香烯乳注射液静脉滴注的安全性较高。在纳入的20例病人中,仅有1例发生轻度静脉炎,停药后症状逐渐消失,余19例病人未发生任何不良反应。2.实验部分:(1)MTT结果显示榄香烯对HCC827细胞株和A549细胞株增殖的影响呈时间-浓度依赖性。对HCC827细胞,作用相同的时间,在20180μg/ml浓度范围内,随着榄香烯浓度的升高,其对细胞的抑制率也逐渐升高,且各组之间差异有统计学意义(P<0.05);在60μ g/ml～160μg/ml范围内,随着榄香烯作用时间的延长,其对细胞的抑制率也逐渐升高,24小时组与48小时组之间差异有统计学意义(P<0.05),48小时组与72小时组之间差异无统计学意义(P>0.05);对A549细胞株,作用相同的时间,在20～180μg/ml浓度范围内,随着榄香烯浓度的增加,其对细胞的抑制率也逐渐升高,且各组之间差异有统计学意义(P<0.05);在40μg/ml～140μg/ml范围内,随着榄香烯作用时间的延长,其对细胞的抑制率也逐渐升高,且各组之间差异有统计学意义(P<0.05)。(2)流式细胞术检测细胞周期结果显示,不同浓度的榄香烯乳注射液作用于HCC827～和A549细胞株后,主要将其阻滞在G0/G1期。(3)实时荧光定量PCR结果显示,不同浓度的榄香烯乳注射液作用于HCC827细胞株,可抑制c-met mRNA的表达,且药物浓度越高,c-met mRNA拷贝数越少,与对照组之间差异有统计学意义(P<0.05)。(4)Western Blot结果显示榄香烯乳注射液可下调HCC827和A549细胞株p-met、met、EZH2、p-Akt蛋白的水平。结论:(1)第一代EGFR-TKIs耐药呈缓慢进展后,继续使用原TKI联合榄香烯乳注射液,可获得3.1个月的中位PFS,并且具有较高的安全性,让患者拥有较高的生活质量,有望成为延缓TKI耐药的策略。(2)榄香烯乳注射液在体外能明显抑制HCC827和A549两种细胞的增殖,将细胞周期阻滞在G0/G1期;在蛋白和基因水平上,榄香烯乳注射液发挥抗肿瘤作用的机制,可能是通过抑制c-metmRNA的表达、下调p-met、met、EZH2、p-Akt蛋白水平、阻断上述蛋白相关的信号通路实现的。P-met、met、EZH2、p-Akt蛋白相关信号通路均与目前已发现的TKIs耐药机制存在密切联系,因此,榄香烯乳注射液有望在克服TKI耐药问题上发挥其作用。