母鼠灌胃T-2毒素对子代小鼠肝脏糖脂代谢及肠道屏障功能的影响研究

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:siman2008
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T-2毒素是单端孢霉烯族A类化合物中毒性最强的一种真菌毒素,广泛存在于玉米、黑麦、燕麦和大麦等农作物中,对人和动物的健康造成危害。T-2毒素大部分在肠道吸收降解,对动物的消化系统以及肝脏产生毒性损伤。研究表明T-2毒素可以穿过胎盘屏障,由妊娠母体进入胎儿,威胁胎儿健康。但是目前对于妊娠母体灌胃T-2毒素对子代影响的研究依然相当有限。因此,本研究以妊娠母鼠为试验对象,在母鼠妊娠后期和泌乳期进行T-2毒素灌胃,阐明母体灌胃T-2毒素对不同时期的仔鼠肝脏和肠道的影响,并结合体外试验进一步阐明T-2毒素损伤肠道的机理。主要研究结果如下:1.母鼠灌胃T-2毒素对子代小鼠肝脏糖脂代谢的影响本试验旨在研究妊娠后期和哺乳期母鼠灌胃T-2毒素对子代小鼠肝脏糖脂代谢的毒性作用。选取30只妊娠ICR小鼠,随机分为三组:0mg/kg·BW、0.005 mg/kg·BW、0.05 mg/kg·BW。从妊娠第14天(GD 14)开始到泌乳期21天(LD 21)结束,连续灌胃28天,诱导母鼠发生毒性反应。在仔鼠出生后21天(PND21),PND28和PND 56,从每组中随机选择3只雌鼠和3只雄鼠,分别采集仔鼠的血清和肝脏进行后续试验。结果表明:与对照组相比,T-2毒素显著降低不同时期后代仔鼠的体重(P<0.05)。血清生化分析发现,与对照组相比,PND 21小鼠T-2毒素组的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平均显著降低(P<0.001),0.05 mg组的甘油三酸酯(TG),总蛋白(TP)和葡萄糖显著增加(P<0.001)。与对照组相比,PND28小鼠的T-CHO水平在T-2毒素组均显著升高(P<0.001),HDL-C水平在0.005mg组显著增加(P<0.05),TG和葡萄糖水平在0.05 mg组显著增加(P<0.001)。与对照组相比,PND 56小鼠的白蛋白水平在T-2毒素组均显著增加(P<0.01),HDL-C和葡萄糖水平在0.05 mg组显著降低(P<0.05)。肝脏组织学观察发现,T-2毒素处理的小鼠肝脏组织出现炎性细胞浸润,肝细胞充血和大量脂滴沉积。肝脏脂质含量测定发现:与对照组相比,PND21小鼠肝脏的TG和LDL-C水平在0.05 mg组显著升高(P<0.01)。PND 28小鼠肝脏的LDL-C水平在0.005 mg组显著升高(P<0.01)。RT-PCR结果显示T-2毒素显著升高PND28小鼠糖脂代谢相关基因的表达,如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖转运子(Glut2)、脂肪酸合成酶(Fas)、乙酰辅酶A氧化酶(Acox1)、过氧化物酶体激活受体α(PPARα)、类固醇反应素结合蛋白1(Srebp1)和CD36。上述结果表明:妊娠晚期和泌乳期母鼠灌胃T-2毒素会引起子代小鼠肝脏糖脂代谢紊乱。2.母鼠灌胃T-2毒素对子代小鼠肠道微生物和肠道屏障功能的影响本研究旨在研究妊娠后期和哺乳期母鼠灌胃T-2毒素对子代小鼠肠道屏障完整性以及肠道微生物菌群的影响。结果显示:妊娠后期和哺乳期母鼠灌胃T-2毒素扰乱仔鼠肠道微生物菌群的平衡,主要表现为降低有益菌相对丰度,如拟杆菌门、毛螺菌,升高有害菌相对丰度,如变形菌门、葡萄球菌和大肠杆菌志贺菌。仔鼠回肠组织形态学观察发现:与对照组相比,T-2毒素组绒毛粘连严重,绒毛组织内空泡化明显。RT-PCR试验结果表明:与对照组相比,PND 21仔鼠T-2毒素组肠道紧密连接蛋白相关基因和炎症相关基因如Occludin,Claudin,ZO-1,白介素-6(IL-6),肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-10(IL-10)表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01,P<0.001),PND56仔鼠的Occludin,Claudin,ZO-1,IL-6,TNF-α和IL-10基因表达水平显著升高(P<0.001)。上述结果表明:妊娠晚期和泌乳期母鼠灌胃T-2毒素会导致仔鼠回肠上皮绒毛损伤和屏障功能受损,这可能是由于肠道有益菌减少,有害菌增加,从而引起肠道炎症,导致肠道免疫能力下降,引起肠粘膜受损。在PND56,肠道屏障功能和炎症相关基因的表达显著升高,可能由于机体的自我恢复机制加强,肠道启动自我修复功能。3.T-2毒素对猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)炎症的影响通过小鼠的体内试验研究我们发现,T-2毒素会损伤仔鼠的肠粘膜屏障,引起肠道炎症。单端孢霉烯族类霉菌毒素的毒性与氧化应激有关,氧化应激会引起肠道上皮细胞凋亡,引起肠道炎症反应。因此,T-2毒素对肠道的损伤可能是通过氧化应激。为了验证我们的猜想,本试验以猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)为研究对象,探讨T-2毒素对肠道炎症反应的影响及其作用机制。结果显示:T-2毒素(4 ng/mL)处理IPEC-J2细胞12 h引起细胞氧化应激,比如显著升高IPEC-J2细胞丙二醛(MDA)浓度和活性氧自由基(ROS)水平(P<0.001),显著降低总超氧化物歧化酶(T-SOD)和过氧化氢酶(CAT)浓度(P<0.01)。加入ROS的抑制剂NAC(4mM)处理后,显著降低MDA浓度和ROS水平(P<0.01,P<0.001),显著升高T-SOD和CAT浓度(P<0.01,P<0.001)。RT-PCR结果显示T-2毒素降低肠道紧密连接蛋白相关基因Occludin,Claudin和ZO-1的表达(P<0.05,P<0.01),促进炎症因子IL-6和TNF-α基因的表达(P<0.05,P<0.001),加入NAC抑制掉ROS后,降低IL-6和TNF-α基因的表达,但无显著影响,显著升高IL-10基因的表达(P<0.05)。蛋白免疫荧光结果发现,与对照组相比,T-2毒素组上调IPEC-J2细胞核转录因子κB(NF-κB)蛋白的表达(P<0.01),加入NAC抑制掉ROS后,NF-κB蛋白的表达显著降低(P<0.01)。上述结果表明,T-2毒素是通过激活ROS/NF-κB信号通路诱导IPEC-J2细胞发生了炎症损伤。综上所述,妊娠后期和哺乳期母鼠灌胃T-2毒素会影响后代仔鼠肝脏糖脂代谢和肠道屏障功能。但是,在一定浓度范围(0.05mg/kg)内,机体本身具有一定的修复功能。体外IPEC-J2细胞试验研究发现T-2毒素对肠道的损伤主要是通过诱导细胞产生过量ROS,促进炎症相关基因和蛋白的表达,引起肠道上皮细胞炎症反应。
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