论文部分内容阅读
白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是对虾的主要病原，该病毒致死率高、传染性强、宿主范围广，是水生甲壳类动物中最为严重的病毒性病原之一。因此，加深对WSSV感染致病机理的理解，寻找高效抗病毒防治方法，意义重大。培养细胞是病毒感染研究的有力工具，在甲壳动物原代细胞培养研究中，螯虾造血组织干细胞(Haematopoietic tissue stem cell，Hpt cell)—Hpt细胞培养较为稳定，是WSSV感染研究的首选。本研究以红螯螯虾(Cheraxquadricarinatus)为研究对象，参照SOderh(a)ll等的研究方法培养红螯螯虾Hpt细胞，分析WSSV在Hpt细胞中的感染特性，筛选Hpt细胞感染WSSV后的差异表达基因，从分子生物学和细胞生物学角度探讨WSSV入胞及其分子调控机制以及宿主细胞抵御WSSV感染机制。 利用分子生物学技术检测WSSV基因表达，结合共聚焦显微镜分析WSSV感染Hpt细胞的过程，结果显示WSSV可在15 min内粘附或进入Hpt细胞，其中可能涉及病毒囊膜与细胞膜融合入胞过程;感染后1h和3h，IE1和VP28分别开始转录表达，表达量持续升高至96 hpi。此外，单病毒粒子成像研究揭示WSSV感染细胞仅占总Hpt细胞的10-15％，提示WSSV对不同类型Hpt细胞可能具有不同嗜性。 为探究WSSV感染Hpt细胞分子机制，我们采用抑制性消减杂交技术(Suppression subtractive hybridization，SSH)分析红螯螯虾Hpt细胞感染WSSV后不同时间(感染极早期1 hpi和感染晚期12 hpi)的基因差异表达。经点杂交筛选、序列测定及生物信息学分析共筛选获得了366个病毒感染相关差异表达基因，其中包括网格蛋白轻链基因(Cq-CLC)和伽马氨基丁酸受体相关蛋白(Cq-GABARAP)，为深入研究内吞和自噬等相关活动在WSSV入侵宿主细胞中的作用奠定基础。 细胞内吞作用是多数病毒侵入宿主细胞的主要途径。为研究WSSV入侵Hpt细胞的途径，我们利用透射电镜观察WSSV入胞过程，结果显示WSSV可以利用网格蛋白介导的内吞(Clathrin-mediated endocytosis，CME)和巨胞饮入侵Hpt细胞;进一步研究发现，利用CPZ和dynasore抑制CME可以明显抑制WSSV的入胞和复制，利用EIPA和rottlerin抑制巨胞饮、利用MβCD和filipin抑制膜穴样凹陷介导的内吞也起到了类似作用，说明WSSV可以利用上述三种内吞方式进入宿主细胞。进一步利用RNAi技术抑制Cq-CLC和Cq-AP50等参与CME过程的关键因子，揭示CME是WSSV入侵宿主细胞的关键途径。 克隆获得Cq-GABARAP的cDNA序列，进一步探讨其介导的WSSV入胞机制。RNAi或添加重组表达Cq-GABARAP蛋白后病毒感染试验表明Cq-GABARAP可以促进WSSV入胞，CPZ阻断CME下游通路能够抑制Cq-GABARAP的促进作用，表明Cq-GABARAP可能通过调节CME上游信号通路以促进WSSV入胞;此外，蛋白互作试验发现，Cq-GABARAP可与包括VP28在内的多个WSSV囊膜蛋白结合，提示Cq-GABARAP与病毒粒子直接结合可能是其促进WSSV入胞的另一机制;电镜观察发现，病毒感染早期WSSV可与自噬小体共定位，自噬调节制剂改变了Hpt细胞自噬活性、进而影响了WSSV入侵Hpt细胞，表明自噬可能参与内吞活动从而调节WSSV入胞。 此外，本研究还发现Cq-GABARAP具有抗WSSV功能。基因表达差异分析显示Hpt细胞中Cq-GABARAP在感染WSSV后表达上调，RNAi或重组表达蛋白孵育后感染病毒试验揭示Cq-GABARAP是一个抗WSSV因子，免疫印迹和电镜观察试验揭示Cq-GABARAP可促进Hpt细胞摄入WSSV，并汇聚入胞病毒粒子成团，抑制病毒粒子入核启动复制，从而发挥抗WSSV作用;雷帕霉素诱导自噬活性增强后，Hpt细胞内WSSV复制受到抑制，说明自噬可能是一种重要的抗WSSV防御反应。 综上，本研究为WSSV感染入胞及其调控机制研究提供了重要信息，并为抗WSSV靶点药物研发提供重要理论基础。