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光合效率是影响水稻产量的重要因素。在本实验室前期研究中,克隆到两个水稻高光效基因NRPC1(negative regulator of photosynthesis and chloroplast development 1)和NRPC2(negative regulator of photosynthesis and chloroplast development 2),通过酵母双杂实验发现NRPC1与GLK1和GLK2都发生互作,NRPC2也与GLK1和GLK2发生相互作用。在此基础上,通过转基因技术获得glk1glk2突变体、glk1glk2nrpc1突变体和GLK1/GLK2过表达材料,将其与NRPC材料进行杂交,对获得的材料进行叶绿素含量测定及光合相关基因的表达分析,确定NRPC与GLK之间的上下游关系,阐明两者对叶绿体发育和叶绿素合成的调控机制;利用RNA-Seq及生物信息学分析,筛选出受NRPC1基因调控的下游基因,结合定量分析检测下游相关基因的表达量。首先,构建GLK1/GLK2的CRISPR/Cas9敲除和过表达载体,利用转基因技术,获得glk1glk2突变体、glk1glk2nrpc1突变体和GLK1/GLK2过表达株系,经叶绿素含量测定及电镜切片分析叶绿体发育状况,光合相关基因的表达分析,发现nrpc1的突变并没有恢复由glk1glk2突变引起的黄化表型,叶绿体发育仍然异常,光合相关基因的表达量仍显著下调,表明NRPC基因位于GLK基因上游;将NRPC1/NRPC2过表达材料与GLK1/GLK2过表达材料杂交,获得NRPC1/NRPC2和GLK1/GLK2双过表达材料,经表型鉴定及叶绿素含量测定分析,发现GLK1/GLK2基因的过表达恢复了由NRPC1/NRPC2过表达引起的黄化表型,其叶绿素含量恢复到野生型水平,光合相关基因的表达量也回复到了野生型水平,由此进一步确定了NRPC基因位于GLK基因上游;对四叶期及抽穗期的野生型,glk1glk2突变体和GLK1/GLK2过表达材料进行NRPC1/NRPC2表达分析,发现NRPC1/NRPC2基因在glk1glk2突变体中几乎不表达,在GLK1/GLK2过表达株系发育后期表达被高度诱导;通过杂交获得nrpc1/nrpc2突变体背景下的GLK1/GLK2过表达株系,发现其叶绿素含量显著提高,光合速率明显增加,并在后期维持深绿色表型,光合相关基因的表达量显著上调。然后,通过RNA-Seq分析技术和生物信息统计学分析,得到102个表达差异基因。与野生型相比,其中有80个基因的表达量在nrpc1突变体中最高,过表达中最低;22个基因在nrpc1突变体中表达量最低,过表达中最高。为了进一步确认表达差异基因的功能及参与的生物代谢途径,进行GO分析,发现表达差异基因主要集中在光合、光反应中心、叶绿体、类囊体等光合相关的场所,但中间也涉及到了跟植物抗性相关的免疫系统过程;并进行KEGG Pathway分析,发现光合作用有关基因的富集率最高,在植物-病原体相互作用中富集明显。利用RT-qPCR对筛选出的抗病相关基因表达情况进行验证分析,在nrpc1突变体背景下,抗病相关基因表达明显上调。白叶枯病菌接菌实验表明,nrpc1突变体材料抗性明显增强,NRPC1过表达材料更易感。综上所述,通过实验证明,NRPC基因位于GLK基因上游,并且对GLK基因的表达有一个负反馈作用,两个基因之间相互调节,以维持水稻中叶绿素合成及叶绿体发育相关基因的正常表达,从而维持水稻的正常表型。NRPC1基因不仅对叶绿体发育和光合反应密切相关,而且其对抗性相关基因也有一定的调控,NRPC1基因突变后可以增加水稻对白叶枯病菌的抗性。这些结果对研究NRPC1基因与GLK基因之间的遗传关系,植物的高光效育种和水稻对白叶枯病菌的抗性研究奠定了基础。