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MERS是中东呼吸综合症的简称。据WHO数据,自2012年9月沙特阿拉伯首例MERS患者被报道至今,全球累计感染者达1690例,其中603例死亡,致死率高达35.6%。MERS的病原体,与冠状病毒SARS-Co V类似,被称为MERS-Co V。临床数据显示,MERS患者会出现急性炎症反应,外周血的淋巴细胞数目减少。人们普遍认为MERS患者致病死亡的主要原因是急性呼吸窘迫所引起的呼吸衰竭。目前MERS-Co V研究的主攻方向在抗体、疫苗、细胞受体和模式动物等方面,导致MERS患者中淋巴细胞数目减少和急性炎症的原因目前尚无深入研究。本室前期研究发现SARS-Co V N蛋白能与宿主体内的MASP2和EF-1A相互作用,同时在对MERS-Co V N和SARS-Co V N蛋白进行同源性分析比对后发现,两者氨基酸序列同源性非常高,那么MERS-Co V N蛋白也可能与宿主体内的MASP2和EF-1A相互作用。MASP2是激活补体系统凝集素途径中一种重要的丝氨酸蛋白酶,当MBL识别病原体上的甘露聚糖糖基后,可以与MASP2结合而激活其酶活性,进而激活补体系统,活化补体,在这个过程中产生的许多补体片段能激活免疫细胞,释放炎症因子,引起局部或全身性炎症反应。EF-1A是一种翻译延伸因子,其主要功能是催化氨酰-t RNA到核糖体上空出的A位点上;但EF-1A除作为翻译延伸因子外还具有许多其他的功能,其中最重要的是调控细胞骨架的组装,与微丝和胞质分裂环的形成有关。本文期望通过对MERS-Co V N蛋白和MASP2相互作用的研究从分子水平揭示MERS-Co V感染过程中产生急性炎症和肺损伤的原因,同时也期望对MERS-Co V N蛋白和EF-1A相互作用的研究从分子水平解释MERS患者外周血淋巴细胞数目减少的原因,从MERS-Co V N蛋白在介导炎症和减少淋巴细胞数以促进病毒的免疫逃逸两个方面部分揭示MERS-Co V的致病机理,为病毒预防、治疗、诊断和药物研发提供部分理论指导。本课题研究的MASP2主要存在于血清中,而MERS患者血清中也检测到较高浓度的N蛋白。通过免疫共沉淀和Alpha技术验证了MERS-Co V N蛋白与细胞过表达MASP2在体外有相互作用,然后构建缺失9个关键氨基酸的MERS-Co V N蛋白突变体,使用免疫共沉淀实验验证了其是与MASP2相互作用的氨基酸位点。同时在原核表达体系中获得了MERS-Co V N蛋白,并通过AKTA系统强阳离子交换层析得到其纯蛋白,被用于体外研究MERS-Co V N蛋白对MASP2功能的影响。利用体外生化水解反应和Western blotting技术验证了纯化的MERS-Co V N蛋白可以激活MASP2,进而促进其对底物C4的水解。之后用可以排除激活补体系统经典途径的去除C1q血清和可以排除旁路途径的补体C4进行补体沉积实验,通过ELISA检测补体C4的沉积情况,实验结果表明MERS-Co V N蛋白可以增强人血清中MASP2的活性。本文为了研究MERS-Co V N蛋白在对MASP2作用,激活补体系统后,对炎症反应的影响,用LPS注射小鼠来模拟病毒入侵过程的急性炎症反应,以腺病毒作为载体在小鼠体内表达MERS-Co V N蛋白,将实验小鼠分组后分别经尾静脉注射表达MERS-Co V N蛋白、缺失9个氨基酸的N蛋白的腺病毒和空腺病毒,蛋白表达三天后向小鼠体内给抗MASP2抗体或C1INH,然后使用LPS诱导急性炎症,一部分动物用于取肺组织做病理切片,一部分动物用于观察生存情况,绘制生存曲线。观察病理切片时,我们发现表达MERS-Co V N蛋白的LPS致炎小鼠比注射空病毒的致炎小鼠出现更严重的肺损伤,肺泡壁明显增厚,白细胞浸润加强,而将抗MASP2抗体或C1INH抑制剂注射到表达MERS-Co V N蛋白的LPS致炎小鼠中,其肺损伤得到明显改善,这说明抗MASP2抗体或C1INH抑制剂可以保护MERS-Co V N蛋白对致炎小鼠的肺损伤。生存曲线显示,表达MERS-Co V N蛋白的致炎小鼠在15hr内有90%死亡,而空病毒和表达缺失9个氨基酸N蛋白的致炎小鼠组中基本无小鼠死亡,特别是给抗MASP2抗体或C1INH抑制剂到表达MERS-Co V N蛋白的致炎小鼠组,小鼠的生存率分别是30%和50%,所以我们得出的结论是:MERS-Co V N蛋白可以通过与MASP2相互作用而加剧炎症和降低LPS致炎小鼠的生存率。本文研究的EF-1A是翻译延伸因子,存在于细胞内,而MERS-Co V也能进入细胞,经免疫共沉淀实验结果证明了MERS-Co V N蛋白既能与细胞内源EF-1A结合也能与细胞过表达的EF-1A相互作用。然后使用蛋白同源模建、同源性分析、二级结构预测等手段,通过PCR构建出一系列关于MERS-Co V N蛋白的截短和缺失突变体,利用免疫共沉淀实验筛选出一些能或不能与EF-1A相互作用的突变体。同时在免疫荧光实验中偶然发现表达MERS-Co V N蛋白的细胞中有多个细胞核,我们推测该现象可能同MERS-Co V N蛋白与EF-1A的相互作用有关,进而将上面筛选的能或不能与EF-1A相互作用的一些突变体转入细胞,经免疫荧光拍照证实能与EF-1A相互作用的突变体就能导致细胞多核,不能与EF-1A相互作用的突变体就不能或者只能引起少量比例的细胞成为多核细胞。综上,我们得到如下结论:MERS-Co V N蛋白与EF-1A相互作用导致细胞多核。为了研究MERS-Co V N蛋白引起细胞多核的机制,构建EF-1A三个结构域A、B、C的五个截短突变体,使用免疫共沉淀的方法验证了EF-1A与MERS-Co V N蛋白结合依赖其C结构域,同时EF-1A与actin蛋白的相互作用也通过其C结构域,那么两者会竞争性结合EF-1A,从而干扰EF-1A与其他蛋白组装形成胞质分裂环。进一步通过超速离心、体外聚合actin聚合体、电镜和免疫荧光等实验证实了MERS-Co V N与EF-1A的相互作用使与actin结合的EF-1A减少,EF-1A对actin bundling的调控紊乱,会形成无活性的actin聚合体,阻止形成正确的胞质分裂环,进而干扰细胞分裂,最终导致多核细胞的形成。胞质分裂受阻将会影响细胞的增殖,本文中,我们用三种淋巴瘤细胞来模拟淋巴母细胞的增殖实验,细胞增殖曲线表明,MERS-Co V N蛋白能抑制三种淋巴瘤的增殖,这可能是MERS患者外周血淋巴细胞减少症状的原因。最后,EF-1A作为翻译延伸因子,在蛋白翻译的延伸中发挥作用,EF-1A能与MERS-Co V N蛋白相互作用,体外蛋白翻译系统实验结果显示MERS-Co V N蛋白能够促进体外蛋白翻译,但N蛋白对翻译的促进效应与两种的相互作用无关。本文中,我们揭示了MERS-Co V N蛋白可以和血清补体系统中MASP2蛋白相互作用而影响其功能,从分子水平上揭示了MERS-Co V感染机体过程中所引起急性炎症反应和肺组织损伤反应的部分机制,可以与细胞内的EF-1A蛋白相互作用扰乱胞质分裂环的形成,抑制淋巴母细胞的增殖,从分子水平解释MERS患者淋巴细胞数目减少的机制,找出了机体在抗病毒感染过程中急性炎症和免疫力低下的原因,对MERS的防治和药物研发都具有重要的参考价值。