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目的:以纳米自组装短肽RADA16-I为支架,将细胞三维(three-dimensional,3D)培养技术与病毒学实验技术相结合,构建腺病毒体外3D培养模型,为体外病毒的分离培养、致病机理研究及抗病毒药物筛选提供一种新的实验研究方法。方法:(1)扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)、透射电镜(transmission electron microscope,TEM)表征RADA16-I材料的结构特征;(2)以RADA16-I为支架构建293T细胞3D培养模型并进行细胞活性分析,主要观察指标:(1)倒置显微镜观察细胞的生长形态;(2)钙黄绿素-AM、DAPI、PI染色观察细胞在支架材料中的形态及活性;(3)MTS法检测细胞在支架材料中的增殖情况;(3)构建腺病毒3D细胞培养模型,主要观察指标:(1)倒置显微镜观察腺病毒感染后细胞在RADA16-I支架材料中的病变情况;(2)MTS法检测腺病毒感染后细胞的增殖情况;(3)绿色荧光蛋白标记检测腺病毒的增殖情况;(4)TEM观察3D培养中的腺病毒颗粒;(5)实时荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time PCR,q PCR)检测腺病毒的增殖情况及复制子的感染性;(6)酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞感染腺病毒后肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的分泌水平。结果:(1)SEM、TEM可见RADA16-I自组装形成高度交叉链接的纳米纤维,纤维均匀较长,交叉成网格结构,并且这些纤维彼此缠绕形成立体3D网络;(2)293T细胞在RADA16-I支架材料中生长情况:(1)倒置显微镜观察可见293T细胞在RADA16-I支架材料中呈微球体聚集生长;(2)钙黄绿素-AM、DAPI、PI染色可见293T细胞在支架材料中生长活性良好,随着培养时间延长,细胞团逐渐增大;(3)MTS实验可见293T细胞能在RADA16-I水凝胶中保持长时间增殖,培养约11-15天时增殖活性最高;(3)RADA16-I水凝胶3D培养体系中的腺病毒培养及细胞生长情况:(1)RADA16-I水凝胶中293T细胞微球体在腺病毒感染后的第5-6天开始出现囊泡、凹陷等改变,9-12天细胞球体开始溶解,能见单个细胞;(2)绿色荧光蛋白标记观察发现,在RADA16-I水凝胶中腺病毒感染细胞后60-72h能见荧光细胞团,初始荧光强度较弱,之后逐渐增多明显,于第8天荧光最强,此后分别在第16天和22天出现另外两次荧光强度小高峰,而在二维(twodimensional,2D)培养中,293T细胞在感染腺病毒24h后开始出现绿色荧光,48-72h荧光最强,且细胞全部出现细胞病变(cytopathic effect,CPE),并于4-6天逐渐坏死脱落;(3)3D培养体系中,在293T细胞感染腺病毒9天及15天后在TEM下观察到增殖的腺病毒颗粒;(4)q PCR检测结果可见3D培养体系中腺病毒载量增加趋势同荧光细胞团计数结果,在第8天明显增加,以后逐渐减少,随之又增加,但不及第一个增殖峰,且该3D体系扩增出的腺病毒仍具有感染性;(5)ELISA检测结果可见腺病毒感染后可刺激293T细胞分泌TNF-α和IL-8,并出现多个分泌峰。结论:以纳米自组装短肽RADA16-I为细胞培养支架,成功构建了腺病毒的体外3D培养模型,该模型有望为体外腺病毒的分离培养、致病机理研究及抗病毒药物筛选提供一种新的实验研究方法。