新型修饰载基因固体脂质纳米粒的研究

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基因治疗为治疗恶性肿瘤、遗传病、病毒性流行病等诸多疾病提供了新的解决途径,因此成为当代医药学和生物学研究的热点,并且正在逐步变成现实。基因治疗的主要目的是成功的将遗传物质传递到目标组织、器官或者细胞。裸露的治疗基因容易被核酸酶降解,表达时效短,导致转染效率很低。因此构建安全高效的基因载体就成为基因治疗领域的一个重要的研究方向。基因载体可分为病毒载体和非病毒载体。和病毒载体相比,非病毒载体具有低免疫原性、易规模化生产、剂型设计灵活、可根据基因的大小和形状进行装配等诸多优势。非病毒载体中的脂质类载体近年来被广泛应用于构建基因传递系统。本课题组在脂质类载体方面做了一些研究,包括脂质体、阳离子固体脂质纳米粒、阴离子固体脂质纳米粒等。在这些脂质类载体中,我们主要集中于研究阳离子固体脂质纳米粒,如何降低其毒性,提高其主动靶向性能,从而提高转染效率,是亟待我们探索的问题。对纳米载体进行修饰,可以降低毒性、提高靶向性,因此成为纳米给药系统的研究热点。   本文采用单硬脂酸甘油酯和卵磷脂为脂质材料,增强型绿色荧光蛋白基因(pEGFP)为报告基因,制备了阳离子载基因固体脂质纳米粒。为降低纳米粒的毒性,设计合成新材料十二烷酸6-(2,6-二氨基-己酰氧基)己酯(LHLN)作为表面活性剂,制备新材料修饰的固体脂质纳米粒;为提高纳米粒的主动靶向性,设计合成靶向因子甘露聚糖和磷脂酰乙醇胺的接枝聚合物(Mannan-PE),对SLN进行表面修饰。课题主要研究方法和结果如下:   1.新型阳离子类脂的合成和性质评价   阳离子固体脂质纳米粒可通过过静电吸附有效的结合DNA,从而介导基因转染。然而毒性问题仍然不可忽视,并和所使用的阳离子表面活性剂的性质有很大的关系。本课题设计并成功合成了一种单链的阳离子类脂LHLN,该类脂以赖氨酸作为阳离子首基团,月桂酸作为疏水尾部,己二醇作为连接物。LHLN的临界胶束浓度(CMC)为0.11mmol·L-1,表面活性较高。使用其作为阳离子表面活性剂,采用纳米沉淀法(溶剂扩散法)制备了新型阳离子固体脂质纳米粒。与常用的阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)制备的固体脂质纳米粒相比,LHLN修饰的阳离子固体脂质纳米粒表面光滑,粒径较小(52.6±6.5 nm),粒度分布较窄(0.12±0.03)。相比于使用CTAB制备的纳米复合物和商品化阳离子脂质体Lipofectamine2000,新型的纳米复合物毒性较低(p<0.05)。因此,该类脂表面活性高,毒性较低,有望推广应用于多种阳离子脂质类载体的构建。   2.新材料LHLN修饰的载基因固体脂质纳米粒   在成功构建新材料修饰的阳离子固体脂质纳米粒后,本部分进一步结合增强型绿色荧光蛋白基因(pEGFP),制备了新型载基因固体脂质纳米粒。LHLN修饰的载基因固体脂质纳米粒(LHLN-SLN-DNA)较为圆整,粒径较小(75.8±9.3nm),粒度分布较窄(0.15±0.02),DNA吸附率较高(90.36%)。LHLN-SLN-DNA还具备良好的抗核酸酶降解的能力和较高的体外血浆稳定性。该基因载体系统在A549和HeLa细胞中的转染效率高于CTAB组(p<0.05),与载基因阳离子脂质体Lipofectamin组效果相当。结果表明新材料LHLN修饰的阳离子载基因质纳米粒可以达到有效的体外基因转染效果,是一种较有前景的非病毒纳米基因传递系统。   3.甘露聚糖修饰的主动靶向载基因固体脂质纳米粒   本文在前两部分设计合成了单链阳离子类脂LHLN,并用于制备载基因阳离子固体脂质纳米粒,取得了相对较低的毒性和较高的转染效率。然而这种给药系统仍然不具备主动靶向特定细胞的能力。因此我们决定使用配体对其进行进一步的表面修饰以达到受体-配体介导的主动靶向的目的。研究发现,甘露糖残基具有靶向肺泡巨噬细胞的能力,而和单糖相比多糖的糖类残基数量更多,更能有效的介导细胞识别和摄取,因此我们选用甘露聚糖作为配体的主体。据文献报道含有脂类的糖类衍生物易于掺和进入纳米载体的表面,因此我们选择磷脂酰乙醇胺作为亲脂的锚定物。本部分设计合成了一种含有甘露聚糖的配体-甘露聚糖的磷脂酰乙醇胺接枝聚合物,将其用于载基因固体脂质纳米粒的表面修饰,制备了甘露聚糖修饰的载基因固体脂质纳米粒(Man-SLN-DNA)。Man-SLN-DNA呈光滑的球形,粒径为125.7±7.5nm,Zeta电位为4.37±1.09 mV,基因结合率为(91.5±1.9)%,体外毒性和转染实验采用鼠类巨噬细胞系RAW264.7进行评价;体内实验采用将修饰纳米粒给药进入大鼠肺部的方式,分离其肺泡巨噬细胞,观测荧光评价转染效果。和未修饰的载基因固体脂质纳米粒以及载基因商品化阳离子脂质体相比,修饰后的载基因固体脂质纳米粒表现出较低的毒性和最好的体内转染效果(P<0.05)。结果表明修饰后的基因载体具有主动靶向的效果,是很有潜力的靶向基因给药系统。   综上所述,新型修饰的载基因固体脂质纳米粒可以有效荷载和保护目的基因,细胞毒性较低、转染效率较高,并且取得了一定的体内靶细胞转染效果,是具有一定发展前景的高效低毒的靶向纳米基因载体。
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