论文部分内容阅读
目的:1.观察皮肤再生医疗技术(Moist exposed burn therapy/Moist exposed burn ointment,MEBT/MEBO)促进体表慢性难愈合创面(简称“慢创”)愈合的药效作用。2.观察MEBT/MEBO对体表慢性难愈合创面组织的苏木精-伊红染色(HE)染色病理形态学的改善作用;并观察全层皮肤愈合过程中,其真皮再生模式及与表皮层、基底膜层再生的关系。3.探究MEBT/MEBO干预PI3K/Akt/mTOR信号通路调控创面蛋白质合成促进体表慢性难愈合创面愈合的修复机制。4.探讨MEBT/MEBO作用IGF-1/PI3K/Akt信号通路调控创面血管生成促进慢创修复的机制。方法:1.将160只雄性SD大鼠随机分为空白组24只、对照组(急性全层皮肤缺损组)34只和体表慢性难愈合创面组102只,慢性难愈合创面组(全层皮肤缺损+注射醋酸氢化可的松)造模成功后再随机分为模型组34只、贝复新组(阳性对照组)34只和MEBT/MEBO组34只。并同时于第3、7、14 d取创面组织。各组分别干预治疗后,观察创面愈合情况,记录统计创面愈合时间;于干预治疗后第3 d、7 d和14 d固定焦距拍照创面计算愈合率。HE染色法观察病理学改变、PAS染色法观察创面基底膜层的生长情况。提取第3、7、14 d创面组织总RNA和蛋白,Real-time PCR和Western blot法检测PI3K、Akt(S473)、mTOR(Ser2448)、p70 S6K(Thr389)、4E BP1(Thr37/46)的mRNA和蛋白转录及表达水平。2.145只雄性SD大鼠,随机分为空白组21只、对照组31只和慢创组93只,慢创组造模成功后再随机分为模型组、贝复新组和MEBT/MEBO组各31只,于干预治疗后第3 d、7 d和14 d取创面组织。碱性水浸泡法扫描电子显微镜技术(SEM)观察创面组织愈合过程中真皮全层再生过程。提取第3 d、7 d和14 d创面组织,分离上清液,ELISA法检测IGF-1含量;提取创面组织总RNA和蛋白,Real-time PCR和Western blot法检测PI3K、Akt(S473)、eNOS(S1177)、VEGFR2的mRNA和蛋白表达水平。结果:1.与模型组比较,MEBT/MEBO组显著缩短大鼠创面愈合时间和提高创面愈合率(P<0.01)。2.造模及干预治疗14 d后,MEBT/MEBO组大鼠创面组织HE染色的病理学形态学改善明显优于模型组。3.MEBT/MEBO组、模型组大鼠创面组织HE染色结果:MEBT/MEBO组第7 d见不成熟的表皮层与真皮浅层的生长,第14 d,表皮细胞及乳头层真皮更趋成熟、完整;而模型组的生长比MEBT/MEBO组晚、同时段比较无MEBT/MEBO组理想。两组PAS染色结果:MEBT/MEBO组第7 d时尚未见PAS阳性带的出现,及至第14 d,可见一条较明显的断续的基底膜层附着于表皮之下、乳头层之上;模型组第14 d仍未见故基底膜层生长或生长很不连续。两组SEM结果:随着时间的推移,MEBT/MEBO组真皮乳头层、网状层先后再生,MEBT/MEBO组第7 d开始见乳头层纤维组织生长,第14 d时见网状层纤维组织生长;慢性组同时段均无MEBT/MEBO组理想。4.干预治疗后第3、7、14 d,各组大鼠创面组织PI3K、Akt(S473)、mTOR(Ser2448)、p70 S6K(Thr389)、4E BP1(Thr37/46)的mRNA、蛋白水平均呈现升高-降低、第7 d最高的表现,第7 d天组间差异最大。各组大鼠创面组织PI3K、Akt(S473)、mTOR(Ser2448)、p70 S6K(Thr389)、4E BP1(Thr37/46)的mRNA、蛋白水平在第3、14 d组间分别同时段比较:模型组、对照组分别与空白组比较,有统计学差异或无统计学差异(P<0.05、P>0.05);模型组与对照组比较,差异有或无统计学意义(P<0.05、P>0.05);贝复新组、MEBT/MEBO组分别与模型组比较,差异有或无统计学意义(P<0.05、P>0.05)。第7 d:模型组与空白组比较,结果有或无统计学意义(P<0.05、P>0.05)、对照组与空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05);模型组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);贝复新组、MEBT/MEBO组分别与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。5.干预治疗后第3、7、14 d,各组大鼠创面组织IGF-1的Elisa定量和PI3K、Akt(S473)、eNOS(S1177)的mRNA和蛋白水平均呈现升高-降低、第7 d最高的表现(VEGFR2逐渐递增、第14 d最高),第7 d组间差异最大。各组大鼠创面组织IGF-1的Elisa定量和PI3K、Akt(S473)、eNOS(S1177)、VEGFR2的mRNA、蛋白水平在第3、14 d组间分别同时段比较:模型组、对照组分别与空白组比较,有统计学差异或无统计学差异(P<0.05、P>0.05);模型组与对照组比较,差异有统计学意义或无统计学差异(P<0.05、P>0.05);贝复新组、MEBT/MEBO组分别与模型组比较,差异有或无统计学意义(P<0.05、P>0.05)。第7 d:模型组、对照组分别与空白组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);模型组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);贝复新组、MEBT/MEBO组分别与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.MEBT/MEBO对体表慢性难愈合创面有较显著的缩短愈合时间、提高愈合率的药效学作用。2.MEBT/MEBO对体表慢性难愈合创面的组织病理形态学的炎性细胞、成纤维细胞、血管新生、皮肤附属器,创面真皮全层生长,基底膜层生长等二维及三维形态学改变均有较明显的改善作用。3.创面组织真皮的乳头层、网状层有着不同的再生模式。真皮乳头层的再生与表皮的再生密切关联。基底膜的生发可能是表皮层同浅层真皮相互作用的终结果。创面愈合中,表皮最先爬覆,真皮乳头层随后生长,网状层生长较乳头层慢,基底膜的形成是在表皮层同浅层真皮均形成之后开始的。MEBT/MEBO组能较理想地促进创面愈合中皮肤全层的生长。4.MEBT/MEBO可较显著促进慢性难愈合性创面的修复,其作用机制可能是:MEBT/MEBO激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,促进大量与愈合相关的蛋白质合成,从而加快大鼠慢创的愈合。5.MEBT/MEBO促创面愈合机制,可能与其干预IGF-1/PI3K/Akt信号通路调控创面新生血管生成、加快创面的愈合速度有关。