背景肺癌每年大约对全球的1.2亿人口造成影响,并成为世界范围内,恶性肿瘤致死的首要原因。在所有肺癌类型中,总数的80%为非小细胞肺癌(NSCLC),其具体类型包括鳞癌、腺癌、大细胞癌等,与小细胞肺癌相比较,非小细胞肺癌增值及扩散的速度相对较慢,主要转移及扩散方式为淋巴转移、血运转移及直接浸润生长等,因非小细胞肺癌相对小细胞肺癌进展速度较慢,因此,其进一步治疗存在可能性。根据美国国家综合癌症网络(NCCN)指南,TMN分期为Ⅲa期以前的非小细胞肺癌首选手术治疗。然而,根据相关文献报导,非小细胞肺癌患者术后长期生存情况并不乐观,对于Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb期非小细胞肺癌患者,其术后的5年生存率分别为80%、60%、55%、40%,而对于已出现对侧淋巴结转移的患者,术后5年生存率则降至13%。过去数十年间,对于Ⅲa期以后及分期在Ⅲa期以前、Ⅰb期以后,已行手术治疗的非小细胞肺癌患者,系统性治疗主要是建立在以铂类为基础的全身化疗,但是,约有20%的病人会出现诸如恶心、呕吐等化疗反应,严重影响患者的生活质量,而且仅有少部分患者能在全身化疗中获益。然而,对于未接受正规系统治疗的非小细胞肺癌患者,只有4-5个月的中位生存期,一年生存率约为10%。因此,寻求对非小细胞肺癌患者最行之有效的治疗方式,降低术后复发率,改善患者预后,成为当前针对非小细胞肺癌的研究热点。近年来,细胞表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的发现,使非小细胞肺癌的系统治疗迈进了一个全新的阶段。以表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKI)为基础的靶向药物的治疗使得非小细胞肺癌的系统治疗逐步向个体化治疗转变。EGFR-TKI的作用机制为竞争性结合EGFR,从而抑制肿瘤细胞的增殖、转移并促进肿瘤细胞的凋亡。相比传统化疗药物,靶向药物具有生物利用度高,选择性强,不良反应轻微等特点。然而,并非所有的非小细胞肺癌患者均适合EGFR-TKI治疗,大量临床研究表明,亚裔无吸烟史的女性腺癌患者为TKI的优势人群,而在优势人群中,仅外显子19或21位突变的患者对该类药物敏感,且部分患者在服用该类药物后,除出现皮疹、腹泻等不良反应外,更会出现对TKI耐药,对患者的后续治疗和生存情况造成巨大影响,因此TKI的耐药问题仍是目前临床应用及基础研究急需解决的问题。在现阶段的研究中,研究这发现磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphotylinosital 3 kinase/protein kinase B/the mammalian target of rapamycin, PI3K/Akt/mTOR)信号转导通路在肿瘤细胞生存和凋亡中发挥着重要作用。初步研究表明,PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活是EGFR-TKI类药物耐药的原因之一。除了这一通路外,近年研究发现,EGFR下游通路Ras-Raf-MEK-ERK的激活也被认为是TKI耐药的重要原因,但其具体机制尚未阐明,因此,我们设计了该临床研究,以期对Ras-Raf-MEK-ERK通路进行初步探索。目的本实验通过收集Ⅰa-Ⅲa期,已行根治性手术治疗的患者的术后组织标本,包括肿瘤组织、肺组织及术中清扫的淋巴结,通过对非小细胞肺癌肿瘤组织中EGFR基因各基因位点、Kras基因及Braf基因等各个基因的突变情况的统计分析,结合文献复习,对Kras基因、Braf基因与EGFR基因之间的关系进行初步探寻,为进一步研究Ras-Raf-MEK-ERK通路导致EGFR-TKI耐药的具体机制奠定基础,并指导临床TKI治疗。方法1、材料：选取2011-2013年间,在解放军海军总医院及301医院经手术治疗的患者共计74例,术后经病理均确诊为非小细胞肺癌,术后或术前未经过放化疗或靶向药物治疗,且无其他系统肿瘤病史,根据UICC指南,TNM分期为Ⅰa-Ⅲa期以前非小细胞肺癌患者,分别记录性别、年龄、吸烟史、肿瘤类型、肿瘤分化程度、肿瘤的TNM分期,肿瘤大小及侵犯程度,淋巴结转移情况等临床资料信息。获取新鲜手术标本,包括瘤体、切除肺叶以及已清扫淋巴结,用中性福尔马林固定16h-24h。其中肺叶标本及术中清扫淋巴结标本只作为分期依据,不行进一步基因检测分析。2、检测方法：2.1基因突变的检测(xTAG-液相芯片技术)：①使用Maxwell系统对FFPE切片中基因组DNA进行提取纯化。②PCR预扩增：以纯化后的DNA作为模板,进行PCR预扩增,在一定条件下,进行酶切反应和ASPE反应。③杂交检测：在反应管中加入PCR产物、微球混合液和杂交液,在95℃条件下反应5min,将混合液放入60℃恒温箱,杂交15min。向混合液中加入链霉亲和素-藻红蛋白,在60℃恒温条件下反应5min。④于Luminex阅读仪上读取数据并进行分析,荧光值≤100判断为野生型,>200判断为突变型。2.2基因突变水平检测应用分支DNA-液相芯片技术,检测手术切除的肿瘤组织中EGFR基因各个位点、Kras基因以及Braf基因的突变情况,具体步骤如下：①将福尔马林固定后石蜡包埋的肿瘤组织(FFPE)样本取出,在其中加入适量裂解液后,置于55℃恒温箱内,在此条件下进行裂解反应2h；②预杂交：在孵育板上加入适量已裂解完成的样品液,依次将支持探针-微球、支持延伸探针及缓冲液加入样品液,置于55℃恒温箱内,震荡仪震荡样液,孵育18-24小时；③吸取上清：翌日,将样本液及孵育板取出,在磁力架上放置2 min,此时磁性微球应向孵育板底部聚集,待磁性微球在底部聚集完成后,吸取上清液,弃置；④洗涤：将洗涤液加入已弃去上清的孵育板中,置于震荡仪洗涤2 min,再次将孵育板置于磁力架上2min,吸取上清液,弃置；重复以上步骤3次；⑤杂交：在样本液中加入扩增延展探针及标记探针,置入55℃恒温箱,震荡1h；⑥洗涤：孵育板放在磁力架上2 min,吸取上清,弃置；重复洗涤2次；⑦信号增强：加入链霉亲和素结合的藻红蛋白,置入50℃恒温箱中,震荡仪30 min；⑧洗涤：取已增强信号的孵育板,置于磁力架上2 min,吸取样本液上清,弃置；重复洗涤2次；⑨读取数据：再次将洗涤液加入孵育板,震荡5 min,置于Luminex阅读仪上,完成数据读取；⑩分析：数据分析,得出检测结果。3、统计学方法EGFR各基因位点、Kras基因、Braf基因的突变情况与患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤类型、肿瘤的TNM分期、肿瘤分化程度、肿瘤大小及侵犯程度,淋巴结转移情况差异性分析采用x2检验,EGFR各基因位点与Kras基因、Braf基因间突变的相关性分析采用Spearman秩相关,所有统计学分析由SPSS13.0完成,p<0.01认为具有统计学意义。结果1、经检测,在74名非小细胞肺癌患者中,EGFR exon18突变率为1.35%(1/74), EGFR exon19突变率为25.68%(19/74),EGFR exon20突变率为0%(0/74), EGFR exon21突变率为20.27%(15/74),Kras基因突变率为25.68%(19/74), Braf基因的突变率为6.76%(5/74)。其中EGFR、Kras、Braf等基因突变在不同性别、年龄、吸烟史、肿瘤分化程度、肿瘤的TNM分期,肿瘤大小及侵犯程度,淋巴结转移情况的患者中无差异性,而在不同病理类型患者中存在差异性,腺癌患者突变率较高,非腺癌患者突变率低。2、经过统计分析,EGFR基因的E19、E21位点突变与Kras基因突变存在负相关(相关系数r分别为-0.345和-0.309,p<0.01),但关系不密切(r<0.5)、EGFR基因的E18、E19、E21位点与Braf(相关系数r分别为-0.032,-0.158,-0.011,p>0.1)不存在相关性、Kras与Braf之间不存在相关性(r=-0.158,p=0.178)。结论1、EGFR基因各位点的突变、在不同病理类型的患者中存在差异,其中,EGFR在腺癌患者中的突变率高于非腺癌患者,而其他临床资料中午差异。Kras基因以及Braf基因的突变情况在不同的临床资料中无差异。2、EGFR基因突变与Kras突变呈负相关,但相关性不大,和Braf基因突变不相关,Kras基因与Braf基因突变不存在相关性,提示EGFR, Kras和Braf等基因的突变为相互独立的过程。3、对于非小细胞肺癌患者,手术切除后,确诊分期为Ia-IIIa期,及早对患者标本进行基因检测,对临床上术后TKI的靶向治疗具有重要的指导意义,同时可以对TKI耐药机制进行进一步的探讨。对于EGFR敏感突变阳性的术后患者,如出现TKI耐药,则应进行Kras以及Braf基因检测,以寻找其他靶向治疗药物。