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研究背景2型糖尿病非酒精性脂肪性肝（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）的主要特征为糖脂代谢紊乱。而盐诱导激酶1（Salt-inducible kinase 1,SIK1）对于糖脂代谢有重要的调控作用,SIK1可磷酸化环磷酸腺苷转录调节共激活因子2（c AMP Regulated Transcriptional Coactivator 2,CRTC2）与固醇调节元件结合蛋白1c（Sterol regulatory Element-Binding Protein 1c,SREBP-1c）,从而影响肝脏糖异生与脂质合成。CRTC2是空腹血糖的关键调节因子,静息状态时被固定于细胞质中,饥饿时,CRTC2被去磷酸化后进入细胞核,与环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（c AMP-Response Element Binding Protein,CREB）结合,激活糖异生相关基因的转录,如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK）和葡萄糖6磷酸酶（Glucose-6-phosphatase,G6Pase）,增加肝脏葡萄糖输出,使空腹血糖升高。SREBP-1c是肝脏脂质合成相关的重要转录因子,被磷酸化入核后,与甾醇反应元件（Sterol Response Elements,SREs）结合,激活催化脂质合成的乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl Co A Carboxylase,ACC）和脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthase,FAS）的转录,促进脂质合成。研究表明,SIK1的激酶活性可促进CRTC2和SREBP-1c的磷酸化,导致二者继续固定在细胞质中,降低其下游靶基因的转录。研究目的我们前期研究发现2型糖尿病模型大鼠肝细胞和高糖刺激后的HepG2细胞内SIK1蛋白表达与活性均下降,并且脂质合成基因表达上调。由此,我们推测高血糖抑制SIK1活性引发的进一步糖脂代谢紊乱可能是2型糖尿病NAFLD进展的重要机制。而本课题组临床验方贞清方,可以降低2型糖尿病NAFLD大鼠的血糖、血脂,并上调SIK1的表达。我们将进一步从细胞水平研究贞清方及齐墩果酸对高糖诱导肝细胞糖脂代谢紊乱的干预机制。研究方法为明确高糖对SIK1及糖代谢的影响,我们使用高糖培养基（25 mmol/l glucose）培养HepG2细胞系和原代小鼠肝细胞,模拟高血糖环境,检测细胞内SIK1与糖代谢基因表达;并在正常糖（5.5 mmol/l glucose）环境下,通过使用抑制剂HG-9-91-01和过表达SIK1腺病毒ad-SIK1处理细胞,观察SIK1被抑制和表达上调后,对CRTC2、SREBP-1c及下游糖脂代谢相关基因的影响。为研究贞清方对高糖诱导的糖脂代谢异常的干预机制,我们在高糖环境下使用二甲双胍、贞清方以及齐墩果酸对HepG2细胞分别进行干预,观察SIK1、CRTC2、SREBP-1c及下游糖脂代谢相关基因表达的变化,以及培养液中葡萄糖含量、细胞中的TG含量的变化。研究结果1.高糖刺激对于HepG2细胞系的生长活性无明显影响。2.高糖刺激可促进HepG2细胞与原代小鼠肝细胞中CRTC2、G6Pase和PEPCK的表达升高。3.高糖刺激下HepG2细胞中CRTC2入核。4.高糖刺激原代小鼠肝细胞引起SIK1核蛋白表达升高。5.HG-9-91-01可导致HepG2和原代小鼠肝细胞的SIK1蛋白及活性下降,CRCT2、G6Pase与PEPCK蛋白表达明显增加,SREBP-1c、FAS和ACC蛋白表达显著增加。6.HG-9-91-01处理原代小鼠肝细胞后细胞培养液中葡萄糖含量较对照组升高。7.HG-9-91-01处理原代小鼠肝细胞后激光共聚焦显微镜下可观察到SIK1、CRTC2和SREBP-1c入核。8.构建过表达腺病毒ad-SIK1并感染原代小鼠肝细胞后SIK1 m RNA显著升高,但蛋白表达无明显变化,并且CRTC2、G6Pase、PEPCK、SREBP-1c、FAS和ACC蛋白表达也与对照组无显著差异。9.HG-9-91-01处理原代小鼠肝细胞后再进行SIK1过表达腺病毒ad-SIK1感染,发现SIK1蛋白表达在HG-9-91-01处理后下降,ad-SIK1感染可使低水平表达的SIK1蛋白水平上调至正常水平。在均使用HG-9-91-01的条件下,相比不使用ad-SIK1感染的细胞组,ad-SIK1感染组CRTC2、SREBP-1c以及G6Pase、PEPCK、FAS、ACC表达均受到抑制,并且细胞培养液中葡萄糖含量下降、细胞内脂滴减少。10.高糖环境可导致HepG2细胞糖异生与脂质合成基因表达上调,细胞培养液中葡萄糖含量以及细胞内TG含量升高;而二甲双胍、齐墩果酸以及贞清方干预可以抑制上述变化,改善由高糖引起的糖异生和脂质合成上调。11.高糖环境下HepG2细胞SIK1蛋白表达下降,磷酸化活性亦减少,SIK1、CRTC2和SREBP-1c向细胞核内迁移;齐墩果酸和贞清方干预可抑制上述入核现象,使SIK1、CRTC2和SREBP-1c保持在细胞浆中,从而抑制了CRTC2和SREBP-1c下游的糖脂代谢基因的表达。结论高糖环境与SIKs抑制剂HG-9-91-01均可以导致HepG2细胞系和原代小鼠肝细胞内SIK1的激酶活性下降并入核。高糖环境可促进HepG2细胞系和原代小鼠肝细胞糖异生相关基因的表达。我们首次发现在正常糖环境下,HG-9-91-01可同时引起原代小鼠肝细胞SIK1、CRTC2和SREBP-1c入核,并且能促进HepG2细胞系和原代小鼠肝细胞糖异生与脂质合成。Ad-SIK1在原代小鼠肝细胞SIK1蛋白低表达的情况下,通过升高SIK1的蛋白表达使得被激活的糖异生作用和脂质合成受到抑制。二甲双胍、贞清方以及齐墩果酸干预可以改善高糖环境诱导HepG2细胞的糖脂代谢紊乱。