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前言精液冷冻是辅助生育技术(ART)领域中的重要技术之一，发展至今已有200多年历史。然而，冻融后的精液质量仍不甚令人满意。目前，冻融后精液质量下降最直观的表现是活力、活率的下降。此外，冷冻还可以造成精子顶体反应，精卵融合能力的下降。冷冻对精子遗传物质即核DNA损伤的研究目前尚无定论。而精子核DNA完整与否关系到父方遗传物质能否被准确无误地传递给子代。因此，本研究采用彗星实验技术，分析冷冻复苏过程对精子核DNA完整性的影响。冷冻复苏过程可导致精液活性氧(reactive oxidative species，ROS)产生增加，使精子处于氧化应激状态(oxidative stress)从而损伤精子。本研究拟在冷冻精液中分别添加精浆中主要抗氧化物质成分：抗坏血酸盐(ascorbate)、过氧化氢酶(catalase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，探讨添加这些抗氧化物质对冻融精子可能的保护作用。用计算机辅助精子分析仪、流式细胞仪、彗星实验分析各实验组冻融后的精子活力(a+b％)，ROS水平，线粒体膜电位(△Ψm)，早期凋亡，核DNA完整性。目的1．分析冷冻复苏过程对健康男性精子核DNA完整性的影响。2．探讨精液冷冻中添加上述几种抗氧化物质：抗坏血酸盐、catalase、SOD对冻融精子可能的保护作用。方法1．采用彗星实验技术，分析冷冻复苏过程对健康男性精子核DNA完整性的影响。2．采用流式细胞仪检测各组精液冷冻复苏后的活性氧水平，线粒体膜电位水平，早期凋亡，结合计算机辅助精液常规参数分析以及彗星实验评价添加这几种抗氧化物质成分对冻融精子可能的保护作用。结果1．冷冻前原始精液彗星细胞率32.3±5.0％，冷冻复苏后精液彗星细胞率32.5±5.0％，与冷冻前相比，差异无显著性意义(t=1.975，P＞0.05)。核DNA损伤指标：精子尾部DNA％(TD％)及Olive尾矩(Olive tail moment，OTM值)冷冻后与冷冻前相比明显升高(48.2±6.3％vs 39.1±7.1％，t=2.956，P＜0.01；10.4±2.8 vs 7.4±2.3，t=2.824，P＜0.01)。2．冷冻前原始精液a+b级精子为：64.7±4.7％，冻融后各组a+b级精子均比冷冻前下降(P＜0.01)，但抗坏血酸盐30μM组与两种浓度的CAT组a+b级精子下降少于阴性对照组(分别为43.5±10.0％、43.9±8.2％、44.3±9.4％vs38.1±7.9％，P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)；相对应组的精子复苏率也明显高于阴性对照组，差异均有统计学意义(分别为67.2±14.1％、68.4±13.8％、68.8±14.8％vs 58.8±10.1％，P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)。而这三组ROS水平则分别低于阴性对照组(分别为29.6±12.8％、30.0±11.2％、30.1±11.0％vs36.7±17.0％，P＜0.05、P＜0.05、P＜0.05)；两种浓度CAT组的△Ψm均高于对照组(分别为34.6±12.9％、32.9±11.2％vs 27.5±10.8％，P＜0.01、P＜0.05)；活的未出现凋亡(PI~-Ann~-％)的精子则抗坏血酸盐30μM组、CAT 200U组高于对照组(分别为14.0±3.8％、13.2±2.6％vs 10.1±4.0％，P＜0.01、P＜0.01)，差异均有统计学意义。其余实验组的检测指标与阴性对照组相比差异无显著性意义，P＞0.05。3．冷冻复苏后各实验组彗星细胞率与对照组相比差异无显著性意义(P＞0.05)。添加抗坏血酸盐300μM组，CAT200U组、400U组的核DNA损伤指标：TD％及OTM值分别低于对照组(分别为41.0±4.2％、39.6±6.6％、40.1±6.2％vs46.1±5.6％，P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01；7.7±1.2、7.5±1.6、7.8±1.9 vs 10.1±3.1，P＜0.01、P＜0.01、P＜0.01)。其余实验组上述指标则与对照组之间差异无显著性意义(P＞0.05)。4．冷冻复苏后各实验组a+b级精子，对照组和抗坏血酸盐600μM组、两种浓度CAT组、SOD400U组的△Ψm，以及对照组和两种浓度抗坏血酸盐组、CAT200U组、SOD200U组的PI~-Ann~-％均分别与本组的ROS水平呈负相关(P＜0.05、P＜0.01)。除抗坏血酸盐600μM组外，其余添加抗氧化剂组TD％、OTM值则分别与其对应组ROS有正相关性(P＜0.05、P＜0.01)。结论1．在慧星实验中，采用彗星细胞率来分析冷冻前后精液DNA损伤情况，发现冷冻不会造成健康男性核DNA损伤精子比例的增多；而采用TD％、OTM指标分析，则冷冻前已损伤的精子核DNA链冷冻后损伤程度增加。由此可见，联合采用彗星细胞率、TD％、OTM指标能更全面地反映冷冻对人精子核DNA完整性的影响。2．合适浓度抗坏血酸盐、CAT作为抗氧化剂应用到人精液冷冻中，可以减少冷冻技术对精液刺激产生的过量ROS，提高冻融精子活力，保护精子线粒体功能，和／或减轻冻融精子凋亡的发生，同时减少ROS对精子核DNA的进一步损伤，从而改善冷冻复苏后精子质量。