根瘤菌广泛分布于土壤中,与豆科植物建立的共生固氮体系是自然界生物固氮体系的重要组成部分。另外,该体系在对重金属污染土壤生物修复过程中具有很大的应用前景。Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123是一株从甘肃铅锌矿区刺槐(Robinia pseudoacacia)根瘤中分离得到的具有铜抗性的根瘤菌。本实验室前期研究工作已经证明,M.amorphae CCNWGS0123的Ⅲ型分泌系统在根瘤菌-豆科植物共生固氮体系的建立过程中起到了积极作用。通过序列比对和文献查阅,推测出nolU是编码M.amorphae CCNWGS0123Ⅲ型分泌系统元件的基因之一,本研究通过构建nolU基因缺失菌株,对nol U功能进行初步研究。1、构建pK18-nolU敲除载体根据M.amorphae CCNWGS0123全基因组序列设计引物扩增nolU基因上下游片段,通过重叠PCR将扩增得到的nolU基因上下游片段进行连接得到目的片段,用相同限制性内切酶同时酶切pK18mobsacB质粒和目的片段,酶切产物回收后用T4 Ligase连接,转化大肠杆菌DH5α。对长出的转化子进行测序鉴定,结果表明目的片段内部没有发生碱基突变,pK18-nolU敲除载体构建成功。2、nol U基因缺失菌株的构建及鉴定利用电转化将敲除载体pK18-nolU转入M.amorphae CCNWGS0123,通过nolU基因上游片段的正向引物Us-1和下游片段的反向引物Ux-2对突变体进行扩增并测序,序列比对结果表明重叠PCR所获得的重组片段确实与目的基因上下游同源臂发生了等位替换,得到nol U基因缺失菌株。3、nol U基因功能研究植物回接实验表明接种△nol U菌株的刺槐与接种野生型菌株的刺槐相比,结瘤数目明显减少,但根瘤形态、植株地上部分高度和根长并无明显差异。另外,通过石蜡切片观察可知,接种△nolU菌株的刺槐所结根瘤的内部结构与接种野生型菌株的刺槐所结根瘤也无明显差异。根据试验结果可知M.amorphae CCNWGS0123中nolU基因的表达受到类黄酮的诱导,推测该基因受到类黄酮和tts box的双重调控,该基因所编码的NolU蛋白可能为一个新型的不保守Ⅲ型分泌系统组成蛋白,在M.amorphae CCNWGS0123与刺槐共生系统建立初期的相互识别过程中发挥重要作用。