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木聚糖是自然界中含量仅次于纤维素的多糖分子。木聚糖结构的复杂性,导致它的完全降解需要多种酶的共同作用才能完成。?-1, 4-内切木聚糖酶(Endo-1,4-?-xylanase,EC 3.2.1.18)能够作用于木聚糖分子中的?-1, 4-糖苷键,水解产生不同长度的木寡糖和少量的木糖,是木聚糖降解酶系中最关键的酶。能产生木聚糖酶的微生物很多,包括丝状真菌、细菌、放线菌等。根据菌株来源不同,其产生的木聚糖酶理化性质均有不同,分子量从7.7到150kDa都有分布,绝大多数在20-40kDa之间,最适pH值在2-11都有分布。根据木聚糖酶催化区域的结构和性质,可将其分为不同的家族,但主要分布于糖苷水解酶第10家族和第11家族,另外在第5,7,8,43家族也有一些分布。木聚糖酶在造纸、食品、饲料、纺织和能源等领域都有广泛的应用前景。工业应用要求酶制剂具有高酶活性、良好的pH稳定性及热稳定性。但由于自然进化的限制,从常规微生物中直接分离得到的天然木聚糖酶因缺乏稳定性,很少能够直接应用于工业生产。到目前为止,有关木聚糖酶产生菌的报道以真菌(如黑曲霉)居多,而细菌类研究偏少。本文针对热解纤维素菌Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725的木聚糖酶开展研究。该菌在70-75℃的高温下可以正常生长,我们推断它所产生的木聚糖酶可能具有良好的热稳定性。该菌株的全基因组已经得到测序,对序列进行分析发现其基因组中共有三种潜在的木聚糖酶基因。其中Gene ID为7407176的木聚糖酶基因(xyn10B)与Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903的?-1,4-内切木聚糖酶具有78%的同源性;与Paenibacillus polymyxa E681的?-1,4-内切木聚糖酶同源性为53%;与其他木聚糖酶的同源性均在50%以下,具有较好的新颖性。因此,我们希望对其进行研究,来发掘性质优良的新型木聚糖酶源。我们对xyn10B基因进行了基因克隆、并在大肠杆菌中进行了高效表达,之后对xyn10B进行了分离纯化和系统的酶学性质表征。结果表明xyn10B以胞内可溶性蛋白形式表达,经过热处理和镍柱亲和层析,xyn10B的纯化效果达到95%以上,纯化倍数为2.47倍,回收率达79.2%,产量达1370mg/L。酶学性质表明,xyn10B最适反应温度为70℃,最适pH为7.2,该酶具有良好的热稳定性,在60℃下的半衰期为300min,在65℃下的半衰期为120min,且在较宽范围的pH条件下具有良好的耐受性。水解产物谱分析表明,xyn10B水解天然木聚糖的主要产物是木二糖。我们通过同源建模的方法构建了xyn10B的三维结构,并通过序列比对和定点突变的方法鉴定了其催化氨基酸残基Glu139和Glu247,为未来对该酶进行工程化改造奠定了基础。xyn10B为热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii)中的第一个被系统表征的木聚糖酶,它具有易纯化、高回收率、高产率、良好热稳定性、广泛的pH耐受性等优点,有望在多种工业生产过程中获得广泛的应用。