硫化氢（H₂S）是一种无色有臭鸡蛋味的气体，大量吸入会导致中毒。然而，很多种哺乳动物细胞自身能产生H₂S，在正常大鼠的血液中H₂S浓度达到46μmol／L。体内的H₂S主要通过含硫氨基酸的代谢产生，胱硫醚-β-合酶（cystathionineβ-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionineγ-lyase，CSE）是两个能分解L-半胱氨酸产生硫化氢的酶，前者主要存在于脑和神经系统，后者分布于心血管系统中。研究发现，生理浓度的H₂S能够增加NMDA受体的敏感性，诱导海马的长时程增强。在心血管系统中，H₂S能开放ATP敏感的钾离子(K_ATP)通道，使血管平滑肌舒张，降低血压；体内H₂S生成减少与自发性高血压的形成有密切关系；外源性给予H₂S能有效保护心肌的缺血性损伤。由于能在体内产生，并具有多种生理功能，H₂S成为继NO和CO后的第三个气体信号分子。血管新生是指在原有血管基础上长出新的毛细血管，这是一个普遍的生理和病理过程，存在于组织生长发育和修复过程中，肿瘤生长也与其关系密切，因而调节血管新生具有重要的临床应用价值。NO和CO都被报道参与血管新生的调控，而这两者与H₂S又存在着互相调节的关系，因此我们设想H₂S是否也能影响血管新生?然而目前在心血管方面对H₂S的研究大多集中在血压调节和对平滑肌细胞的作用上，在内皮细胞和血管新生领域，H₂S的作用尚无人报道。因此通过我们对H₂S在血管新生方面的探讨，将更完善地认识这个新的气体信号分子。首先，检测内皮细胞上CSE和CBS的表达。我们选用三种不同种属、不同来源的内皮细胞：原代培养的大鼠心脏微血管内皮细胞（CMEC）以及ATCC收录的细胞株恒河猴脉络膜微血管内皮细胞RF／6A和小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3，分别设计CSE、CBS以及管家基因的上下游引物，用RT-PCR的方法进行检测。结果显示三种内皮细胞都扩增出CSE基因相应的特异条带，而CBS基因则都未扩增出相应产物，说明内皮细胞上存在CSE基因的表达。接着分别用兔抗CSE和CBS多克隆抗体对CMEC进行免疫荧光染色，发现CSE抗体染色为阳性，CBS抗体染色为阴性，说明内皮细胞能够表达CSE蛋白。这是首次发现内皮细胞上存在CSE的表达，提示H₂S可能在内皮细胞上发挥一些生理学功能。其次，研究H₂S对内皮细胞的作用以及对体外血管新生的影响。用MTT法研究发现高浓度（500-1000μmol／L）的H₂S供体硫氢化钠（NaHS）使细胞活力显著下降，而低浓度（1-200μmol／L）则对细胞活力没有影响，说明高浓度的H₂S可能存在细胞毒性。接着用BrdU掺入法检测低浓度H₂S对细胞增殖的影响，结果显示10和20μmol／L的NaHS能促进细胞增殖。然后检测了H₂S对内皮细胞粘附、迁移以及管腔形成的影响，结果表明低浓度H₂S不同程度地促进了细胞的粘附、迁移以及管腔形成能力。说明H₂S能促进体外的血管新生。我们进一步探讨了H₂S促进体外血管新生的机制。Western blot显示H₂S能促进细胞内信号分子Akt的磷酸化，并具有时间和浓度依赖性，用PI3K（Akt上游信号分子）的阻断剂wortmannin或LY 294002能够阻断这种效应。预先给予内皮细胞PI3K的阻断剂或者用显性负表达的Akt质粒（DN-Akt）转染内皮细胞，H₂S的促进细胞迁移和管腔形成的效应被阻断。说明H₂S促进体外血管新生可能通过PI3K／Akt通路。对于另两个信号分子Erk和p38，H₂S未能促进其磷酸化。进一步研究发现，H₂S使Akt的下游信号存活素（survivin）蛋白表达增加，后者能促使细胞存活，促进血管新生。另外，我们还检测了整合素（integrin）的表达情况，发现H₂S能促进整合素α2和β1的表达，而对整合素α1、αv、β3和β5没有明显影响。最后，研究H₂S对体内血管新生的影响。采用C57小鼠的皮下注射基底膜抽提物形成基质栓（Matrigel plug）模型，通过对Matrigel plug切片的HE和Masson三色染色，发现H₂S使Matrigel plug中细胞浸润增加，血管样结构增多。对内皮细胞特异性标志物CD 31进行免疫组化染色，证实浸润的细胞大多为内皮细胞，且围成很多管腔样结构。进一步用TMB比色法测定显示H₂S使Matrigel plug中的血红蛋白含量增加。以上结果说明H₂S能促进体内的血管新生。此外，我们还构建了持续过表达和显性负表达的survivin质粒，为今后进一步研究H₂S的作用机制打下基础。总之，我们在实验中发现内皮细胞上存在CSE的表达，H₂S能促进体内外的血管新生，这种作用可能与激活PI3K／Akt信号通路相关。