片段DNA分析方法和核苷酸计量标准研究

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片段DNA是目前基因诊断、基因分型和DNA指纹研究等新技术、新方法中重要的试剂,其应用的普遍性和必要性不言而喻,其计量特性要求十分严格。但目前DNA片段长度和分子量标准主要来源是购自生物公司,价格昂贵且质量和溯源性无法保障,无法满足实验室认可和计量认证过程对DNA片段长度和分子量标准的需求。本文探究了100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp片段DNA的制备纯化分析方法和定量分析方法;建立了磁珠与琼脂糖凝胶回收相结合和变性HPLC两种纯化方法,通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计、芯片电泳、dHPLC等测试手段对两种方法的纯化效果进行了检验,两种方法纯化彻底,可以有效去除PCR扩增产物中的盐、引物、其他片段DNA等杂质;在纯化的基础上,采用同位素稀释质谱定量分析方法,对论文中制备纯化后的片段DNA进行定值分析。片段DNA制备纯化方法与定量分析方法的探究为研制准确、有效及可溯源的片段DNA标准物质提供了技术参考。次黄嘌呤核苷酸(IMP)和鸟嘌呤核苷酸(GMP)具有呈味性,与谷氨酸钠具有协同效应,可提高鲜味数十倍,是反映鸡精调味料质量的主要指标。因此鸡精产品中核苷酸的质量监控极为重要,但我国现行的核苷酸检测标准均为企业标准和行业标准,国家级检测标准仍为空白,这限制了国家对复杂基体中核苷酸的检验。本文优化了核苷酸提取条件,建立了有机溶剂沉淀核苷酸的提取方法;建立了高效液相色谱外标法和离子色谱外标法两种核苷酸定量方法。并以市售鸡精为基体,研制了呈味核苷酸含量基体标准物质,以核苷酸国家一级标准物质为标准,采用建立的高效液相色谱外标法、离子色谱外标法对鸡精基体中呈味核苷酸(GMP和IMP)含量特性量值进行了确定,检验了标准物质的均匀性,均匀性良好;考察了本文研制的呈味核苷酸含量基体标准物质的稳定性,发现在一年内标准物质的特性量值没有显著差异;建立了呈味核苷酸含量基体标准物质不确定度评定模型,评定了标准物质的不确定度。本文提供的呈味核苷酸含量基体标准物质的研制和评价为检测复杂基体核苷酸提供了标准依据和技术方法。
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