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本研究以矮牵牛为实验材料,用根癌农杆菌介导的叶盘转化法将异戊烯基转移酶(IPT)基因导入矮牵牛,获得转基因植株,旨在通过表达IPT延长转化植株的花期。
本论文工作主要包括高频再生体系的建立:取无菌苗叶片,接入诱导分化培养基MS+0.2mg/LNAA+2mg/L6-BA+2g/L酸水解酪蛋白出芽,再生频率达到98%以上;将幼苗放在生根培养基1/2MS+1mg/LIBA上,生根率达100%。Hm筛选压浓度的确定:将无菌苗叶片接种到含有不同Hm浓度的分化培养基中,测验其对愈伤诱导的抑制效果。结果表明抑制叶盘愈伤分化的筛选压Hm浓度为5mg/L。
转化体系的建立:矮牵牛的最适转化条件是用OD600=0.5的农杆菌菌液侵染叶片15min,放在MS+0.2mg/LNAA+2mg/L6-BA上,暗培养3d,后用含500mg/LCef的无菌水振荡,无菌水冲洗,然后用MS0冲洗,用无菌滤纸吸干水分,转入MS+0.2mg/LNAA+2mg/L6-BA+100mg/LCef+5mg/LHm培养基上进行选择培养,直至再生出芽,将再生芽转入1/2MS+1mg/LIBA+0.4mg/LHm生根筛选培养基上诱导生根。
转基因植株的检测:转基因植株的PCR检测,提取农杆菌质粒DNA和经过Hm筛选的转化植株总DNA,进行目的基因PCR扩增。经电泳检测,18个抗性植株中有6个扩出了与阳性对照相同的特异性条带,初步证明目的基因已插入植物基因组中。
转基因植株的RT-PCR检测,以ipt特异的引物对5、7、15、17号转化植株的CDNA进行PCR扩增得到500bp特异的片段,证明在这些转化株系中目的基因都有一定量的表达.。
转基因植株的表型:转基因植株早期主要表现为叶片缩小,节间缩短,侧芽增多和根生长缓慢。