研究背景：甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤,甲状腺癌已成为近年来发病率增高最快的恶性肿瘤之一,且女性居多。甲状腺癌可分为来源于甲状腺滤皮上皮的甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡状癌、甲状腺未分化癌和来源于滤泡旁C细胞的甲状腺髓样癌。其中,甲状腺乳头状癌和甲状腺滤泡状癌被传统定义为分化型甲状腺癌,发病率在90%以上,不但病情进展缓慢,而且治疗效果较好；甲状腺未分化癌虽然发病率很低,但是死亡率极高,预后极差。在分化型甲状腺癌中,存在部分患者分化程度偏低,或原本属于高分化型甲状腺癌的患者随着病情进展及放射性131I治疗次数增多使分化程度降低,其分化程度低于高分化型甲状腺癌,但高于未分化型甲状腺癌,被称为低分化甲状腺癌(PDTC)。高分化甲状腺癌通过甲状腺切除术、放射性131I治疗及后续甲状腺激素抑制治疗,大部分患者临床疗效及远期预后较好。然而,低分化型甲状腺癌及未分化型甲状腺癌患者对放射性131I治疗反应性较差,尤其未分化型甲状腺癌患者几乎不摄取放射性碘,这就使这部分患者的临床疗效及远期预后不佳。如何提高低摄碘及不摄碘甲状腺癌患者的摄碘率,对改善其临床疗效及远期预后至关重要。在甲状腺癌的发病过程中,某些基因发生突变或移位、甲基化等异常时,会通过激活相关的信号通路导致细胞异常增殖或者凋亡,导致癌变,常见的基因突变包括钠碘同向转运体(NIS)本身突变及BRAF、RAS、PTEN等调控NIS表达的基因突变,基因易位如RET/PTC、PAX8(配对盒基因8)/PPARγ(过氧化物酶增殖物激活受体γ)等各种基因转录或者表达异常,都有可能通过调控某些特定的细胞信号传导通路,诱发细胞突变,从而导致细胞异常增殖或者凋亡,导致癌变。甲状腺癌的发生、发展、侵袭、转移与许多信号通路或相关基因表达有关,比较重要的信号通路有促甲状腺激素受体(TSHR)通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、Noth信号通路等,其他的信号通路还包括核转录因子-κB (NF-κB)、WNT-β-catenin、 JAK激酶-信号转导因子、STAT转录活化因子等。但关于甲状腺癌细胞摄碘率降低的相关机制研究很少。放射性131I治疗甲状腺癌的基础是甲状腺癌细胞能够摄取放射性碘。碘在甲状腺细胞中转运主要分为两个步骤：首先,碘在NIS蛋白的介导下经甲状腺滤泡细胞基底膜逆电化学梯度转运到细胞内,然后,由两种蛋白介导,包括pendrin表达蛋白和人类顶膜碘转运体(hAIT)蛋白,这两种蛋白将碘从细胞顶端顺电化学梯度运送入滤胞腔。在这个过程中,Na+/I+一三磷酸腺苷(ATP)酶作为能量供应者,在Na+顺化学梯度内流时,将碘以Na+：I-为2：1的方式转运进入甲状腺细胞。NIS蛋白主要在靠近毛细血管的甲状腺滤泡细胞基底膜上表达,在乳腺组织、卵巢、睾丸、腮腺、唾液腺、泪腺、颌下腺、肾上腺、胰腺、心脏和胸腺、直肠等器官中也有少量表达。目前人们认识到甲状腺癌细胞摄碘能力存在缺陷,主要集中在两个方面：一是NIS蛋白表达减少或缺失；二是NIS在细胞内的定位障碍。促甲状腺激素(TSH)是NIS表达的主要调控因子,另外,其转录因子也与NIS的调节有关。TSH、甲状腺转录因子-1 (TTF-1)、PAX-8、环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)、β-连环蛋白、发状分裂相关增强子-1(Hes-1)、固醇调节因子结合蛋白(SREBPs)、垂体肿瘤转化基因(PTTG)、垂体肿瘤转化基因结合因子(PBF)、叉头状转录因子1(FoxEl)等因子分别通过不同通路调节钠碘同向转运体基因启动子(NIS_PP)和钠碘同向转运体上游增强子(NUE)的活性,促进或抑制NIS的表达及定位。NIS翻译后的修饰,如磷酸化、糖基化等也参与其中。配对盒基因8(PAX8)是属于细胞限制性转录因子,该蛋白最早在小鼠甲状腺的发育过程出现,随后发现在甲状腺滤泡状癌中呈高度表达。PAX8不仅能够调控甲状腺球蛋白(Tg)、甲状腺过氧化物酶(TPO)和促甲状腺受体的基因启动子,调节甲状腺细胞的增殖和分化,而且还是调节NIS_PP和NUE活性的重要因子。NIS的表达受到TSH的调控且需要PAX8启动NIS基因的启动子。硼替佐米作为一种蛋白酶体抑制剂,在治疗难治性或复发性骨髓瘤、淋巴瘤、急性髓系白血病、其它类型的浆细胞疾病以及某些实体肿瘤中具有令人瞩目的疗效。其中,硼替佐米治疗多发性骨髓瘤的机制与抑制NF-κB有关,在肿瘤细胞中,蛋白酶体26S亚基的活性被硼替佐米特异性抑制后,能够明显减少NF-κB抑制因子(IKB)的降解,IκB与NF-κB结合后能有效抑制NF-κB的活性,抑制与细胞增殖、分化相关的基因的表达,减少骨髓瘤相关粘附因子的表达和细胞生长因子的分泌,最终导致肿瘤细胞的增殖减少和凋亡。已有研究证实,硼替佐米能够延迟多种肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡,并抑制新生血管的形成；不仅如此,硼替佐米还可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,以及改善骨髓瘤细胞对阿霉素、马法兰和地塞米松等药物的耐药性。Annette Altmann等在甲状腺未分化癌中进行硼替佐米抗肿瘤研究时,发现硼替佐米处理后甲状腺相关因子PAX8、 TTF-1等表达增加。然而,尚未有研究证实硼替佐米对甲状腺癌的治疗作用,故我们尝试用硼替佐米处理各种类型甲状腺癌细胞,以PAX8蛋白为切入点,观察硼替佐米对PAX8蛋白的影响,继而观察调节PAX8蛋白表达对甲状腺癌细胞摄碘率的影响,试图为临床低摄碘甚至不摄碘的甲状腺癌患者的放射性131I治疗寻找新的思路。目的：1.观察不同类型的甲状腺癌细胞中PAX8蛋白的表达差异。2.观察硼替佐米处理后对各种类型甲状腺癌细胞中PAX8蛋白表达的影响,探讨硼替佐米在促甲状腺癌分化中的作用。3.观察不同类型甲状腺癌细胞膜上NIS蛋白的表达差异。4.观察硼替佐米处理后不同类型的甲状腺癌细胞膜上NIS蛋白在细胞膜上的表达情况。5.检测硼替佐米处理后的不同类型的甲状腺癌细胞的细胞摄碘率是否改变,探讨硼替佐咪是否有促进甲状腺癌分化的效果,企图为临床甲状腺癌放射性131I治疗寻找新的思路。方法：1.细胞分组及培养：(1)接种细胞：用胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞,接种于6孔板上,每孔3×105个细胞,每孔加入2m1上述完全培养基,充分混匀,在37°C、5% CO2、饱和湿度孵箱中培养24小时,待细胞贴壁后换含低浓度(2%)血清培养基饥饿24小时；(2)配制含不同浓度硼替佐米的培养液：无菌RPMI 1640培养基,加10%胎牛血清、1%双抗及2mM/L谷氨酰胺,含硼替佐米28ng/mL、56ng/mL、112ng/mL、 196ng/mL、280ng/mL,混匀；(3)用吸管吸掉旧的培养液,用PBS冲洗2遍,将细胞分别加入上述含不同浓度硼替佐米的培养液,在37°C、5%CO2、饱和湿度孵箱中培养,培养时间分别为24小时、48小时；2.筛选硼替佐米作用的最佳浓度及时间：分别以浓度为28ng/mL、56ng/mL、112ng/mL、196ng/mL、280ng/mL的硼替佐米处理不同类型甲状腺癌细胞24小时和48小时,CCK-8检测硼替佐米处理后甲状腺癌细胞活力,寻找最佳作用浓度和最佳作用时间进行后续实验。3. Western blot技术检测硼替佐米处理前后的不同类型甲状腺癌细胞中PAX8蛋白表达情况。4. Western blot技术检测硼替佐米处理前后的不同类型甲状腺癌细胞中NIS蛋白在细胞膜上的表达情况。5.利用125I检测各种甲状腺癌细胞的摄碘率,判断硼替佐米是否可以促进甲状腺癌细胞的分化,提高细胞摄碘能力。采用SPSS 19.0统计软件处理数据。以均数±标准差(mean±SEM)表示计量资料。采用student t检验(student’s t test)进行两组数据间的比较。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行多实验组间的比较。显著性检验标准α=0.05,P<0.05时认为有统计学意义。结果：1.硼替佐米处理不同类型甲状腺癌细胞24小时后,检测细胞活力,甲状腺乳头状癌细胞B-CPAP:对照组(98%)、28ng/mL(94%)、56ng/mL(86%)、112ng/mL (80%)、196ng/mL(76%)、280ng/mL(69%),甲状腺低分化癌细胞WRO 82-1:对照组(98.3%)、28ng/mL(94%)、56ng/mL (88%)、112ng/mL (84%)、 196ng/mL(77%)、280ng/mL(71%),甲状腺未分化癌细胞ARO：对照组(99.7%)、28ng/mL (95%)、56ng/mL (89%)、112ng/mL (84%)、196ng/mL (78%)、 280ng/mL (74%);硼替佐米处理48小时后,检测细胞活力,甲状腺乳头状癌细胞B-CPAP:对照组(76%)、28ng/mL (71%)、56ng/mL (62%)、112ng/mL (48%)、196ng/mL(42%)、280ng/mL(36%),甲状腺低分化癌细胞WRO 82-1：对照组(78.7%)、28ng/mL (74%)、56ng/mL (65%)、112ng/mL (53%)、 196ng/mL(44%)、280ng/mL(39%),甲状腺未分化癌细胞ARO：对照组(81.7%)、28ng/mL (77%)、56ng/mL (68%)、112ng/mL (54%)、196ng/mL (47%)、 280ng/mL (43%)。IC50对应浓度为112ng/mL,故筛选其为最佳实验浓度进行后续实验。硼替佐米处理48小时后各组细胞中细胞存活率差异较处理24小时后差异明显,因此后续实验选择作用时间为48小时。2.未加硼替佐米处理细胞前,利用Western blot技术检测正常甲状腺细胞和各类型甲状腺癌细胞中PAX8蛋白的表达,发现在正常甲状腺细胞中PAX8蛋白的表达最高,甲状腺乳头状癌细胞表达次之,甲状腺低分化癌细胞及甲状腺未分化癌细胞中表达最低,且前者较后者表达高。3.浓度为112ng/mL的硼替佐米处理48小时后,Western blot技术检测各类型甲状腺癌细胞中PAX8蛋白表达,结果均较处理前明显升高。4.未加硼替佐米处理细胞前,利用Western blot技术检测正常甲状腺细胞和各类型甲状腺癌细胞膜上NIS蛋白的表达,发现在正常甲状腺细胞膜上NIS蛋白的表达最高,甲状腺乳头状癌细胞膜表达次之,甲状腺低分化癌细胞膜再次之,甲状腺未分化癌细胞膜表达最低。5.浓度为112ng/mL的硼替佐米处理48小时后,Western blot技术检测不同类型甲状腺癌细胞中NIS蛋白在细胞膜上的表达,结果显示没有明显提高。6.浓度为112 ng/mL的硼替佐米处理48小时后,利用125I检测各种甲状腺癌细胞的摄碘率,结果显示各种甲状腺癌细胞的摄碘率较对照组均没有明显提高。结论：1.在不同类型甲状腺细胞中,PAX8蛋白的表达存在差异,其中在正常甲状腺细胞中表达最高,甲状腺乳头状癌细胞表达次之,甲状腺低分化癌细胞及甲状腺未分化癌细胞中表达最低,且前者较后者表达高,差异具有统计学意义。2.浓度为112ng/mL的硼替佐米处理不同类型甲状腺癌细胞48小时后,PAX8蛋白的表达均较未处理组有所提高,差异具有统计学意义。3.在不同类型甲状腺细胞膜上,NIS蛋白的表达存在差异,其中在正常甲状腺细胞膜上表达最高,甲状腺乳头状癌细胞膜上表达次之,甲状腺未分化癌细胞膜上表达最低,甲状腺低分化癌细胞膜上表达较甲状腺未分化癌细胞膜上表达高,但低于甲状腺乳头状癌细胞膜上表达,差异具有统计学意义。4.浓度为112ng/mL的硼替佐米处理不同类型甲状腺癌细胞48小时后,NIS蛋白表达没有明显影响。5.浓度为112ng/mL的硼替佐米处理不同类型甲状腺癌细胞48小时前后,各类型甲状腺癌细胞摄碘率未见明显差异。