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背景及目的 心房颤动(房颤)是临床上非常常见的快速型心律失常,发病率随年龄增加而增长,可诱发或使心力衰竭加重,导致脑卒中,致残、致死率高,严重威胁人类的生命健康。目前,房颤的发病机制仍未完全明确,努力探索房颤发生的潜在分子机制,寻找新的、有效的干预靶点,将对房颤的治疗起到积极的意义。研究表明,心房电重构是导致房颤发生的主要原因之一,它主要表为离子通道和缝隙连接蛋白(Connexin,Cx)特性的改变,导致延迟后除极和触发活动的增加,心房动作电位时程及有效不应期缩短、不应期离散度增加,传导速度减慢和传导异质性增加。电重构所致的上述心房电生理改变,为异位激动灶和局部微折返的形成提供了必要的基质,从而促进房颤的发生与维持。由Cx构成的缝隙连接蛋白,是细胞间电信号和化学信号传递的重要通道,对于维持心肌细胞正常电传导,实现心房或心室的同步收缩起着重要的作用。Cx43由GJA1基因编码,它是哺乳动物心房最主要的Cx之一,大量的研究证据表明,Cx43数量、功能和空间分布异常所致的心房Cx43重构与房颤的发生密切相关。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类长度约18-22个核苷酸的小分子RNA,它通过与靶基因mRNA 3’端非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)结合,在转录后水平调控基因的表达。多个miRNAs,如miRNA-206、miRNA-208等均被证实与房颤的发生密切相关。根据生物信息预测,miRNA-613与miRNA-206均属同一家族,具有相同种子序列,可能有相似生物学功能。更为有趣的是,编码Cx43的GJA1是miRNA-613潜在的靶基因,提示miRNA-613可能与房颤Cx43重构的调控有关。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度超过200核苷酸的非编码RNA,最初被广泛认为是“转录垃圾”,但随着进一步研究,研究者们发现其结构与mRNA相似,与细胞分化、凋亡和各系统疾病相关,能参与复杂的调控功能。研究发现lncRNAs与心力衰竭、扩张型心肌病、心肌梗死等心血管疾病有关。近期的研究显示,lncRNAs可能在房颤的发病中同样扮演者重要的角色。同源异形框基因转录反义RNA(Hox transcript antisenseRNA,HOTAIR)是最近发现与心脏发育及心肌梗死等心血管疾病相关的一种lncRNA,但HOTAIR是否房颤的发生有关,尚未见报道。生物信息学预测同样提示,HOTAIR是miRNA-613潜在的靶基因。而LncRNAs作为miRNAs“分子海绵”,通过与miRNAs靶基因竞争性结合mRNAs,调节靶基因的表达,是其发挥生物学调控的重要机制之一。已有多项研究报道,HOTAIR作为miRNA-613的“分子海绵”,与靶基因竞争结合miRNA-613,从而调控靶基因的表达。那么是否HOTAIR作为竞争性内源性 RNA(Competeing endogenous RNA,ceRNA),通过与 GJA1 竞争结合miRNA-613调控Cx43的表达,尚未见报道。本项目探索HOTAIR是否通过调控Cx43参与房颤的发生及其参与Cx43调控的可能机制,以期为房颤的干预提供新的靶点。方法 (1)本研究通过收集广西医科大学第一附属医院心脏外科行心脏瓣膜修补或置换术的瓣膜性心脏病患者右心房组织标本,分为窦性心律(SR)组和房颤组(AF),采用荧光定量聚合酶链式反应(Realtime quantity PCR)、蛋白免疫印迹技术(Westem-blot)检测上述两组患者HOTAIR、miRNA-613和Cx43 mRNA和蛋白的表达水平。(2)利用HOTAIR过表达慢病毒载体转染小鼠心房肌细胞(HL-1),构建过表达HOTAIR的HL-1细胞模型,利用RT-qPCR、Westem-blot检测HL-1细胞中Cx43 mRNA和蛋白表达,从而观察HOTAIR对小鼠心房肌细胞Cx43表达的影响。(3)利用miRNA-613 mimics转染HOTAIR过表达HL-1细胞,利用Western-blot检测HL-1细胞中 Cx43 蛋白的表达水平的变化,miRNA-613 mimics,miRNA-613 mim-ics+HOTAIR过表达慢病毒载体分别转染HL-1细胞,利用Westem-blot检测HL-1细胞中Cx43蛋白表达水平的变化。从而验证HOTAIR通过miRNA-613,调控Cx43表达。(4)最后,采用双荧光素酶报告基因检测系统验证编码Cx43的GJA1是miRNA-613直接作用的靶基因,从而进一步证实HOTAIR作为ceRNA,通过与GJA1竞争性结合miRNA-613,调控小鼠心房肌细胞Cx43的表达。结果 (1)对房颤组(23例)和窦性心律组(22例)患者的临床数据进行分析,两组患者性别、年龄、病种构成、左室收缩末径和舒张末径、左室射血分数比较差异无统计学意义(P>0.05)。房颤组患者左房内径(53.43mm±11.21mm)明显大于窦性心律组(44.45mm±7.58mm)(P<0.01)。房颤组患者右心耳组织HOTAIR表达水平(1.8184±0.6444)明显低于窦性心律组(2.5396±1.0202)(P<0.05)。但房颤组患者右心房组织miRNA-613相对表达水平(1.9010±0.75)与窦律组(1.8201±0.8384)相比较差异无统计学意义(P>0.05)。房颤组患者右心房Cx43 mRNA表达水平(1.9844±0.4707)明显低于窦性心律组(2.4179±0.5498)(P<0.05)。房颤组患者右心房Cx43蛋白表达水平(0.266±0.151)也明显低于窦性心律组患者(0.422±0.179)(P<0.05)。(2)HOTAR过表达组HL-1细胞Cx43 mRNA表达水平(4.8882±1.0126)明显高于空白病毒转染组组(0.4872±0.0542)(P<0.05);同时,HOTAIR过表达组HL-1细胞Cx43蛋白表达水平(1.6111 ±0.1620)明显高于高于空白病毒转染组(0.4761±0.0931)(P<0.05)。(3)与空白病毒载体转染组(0.4299±0.0880)比较,HOTAIR+miRNA-613阴性对照组HL-1细胞Cx43蛋白表达水平(2.3297±0.3116)明显升高(P<0.0001),而 HOTAIR+miRNA-613 组 HL-1 细胞 Cx43 蛋白表达水平(0.3834±0.0723)则明显低于 HOTAIR+miRNA-613 阴性对照组(P<0.0001),但与空白病毒载体转染组比较无差异(P>0.05)。(4)与空白对照组(0.8007±0.0547)和 miRNA-613 阴性对照组(0.8491±0.0508)比较,miRNA-613组HL-1细胞Cx43蛋白表达水平(0.135±0.0028)明显下降(P<0.0001);而miRNA-613+HOTAIR组的HL-1细胞Cx43蛋白表达水平(0.0853±0.0074)则明显高于miRNA-613组,但仍明显低于空白对照组和miRNA-613阴性对照组。(5)与miRNA-613阴性对照组+GJA1 3’-UTR野生型组(4.9664±2.0499)比较,miRNA-613+GJA1 3’-UTR野生型组萤火虫(firefly)/海肾(Renila)荧光素酶比值(2.5562±0.7087)明显下降(P<0.05);miRNA-613+GJA1 3’-UTR 突变型组 firefly/Renila 值(4.7680±1.2353)与miRNA-613阴性对照组+GJA1 3’-UTR突变型组(5.8508±2.839)无明显差异(P>0.05),但较miRNA-613+GJA1 3’-UTR野生型组明显升高(P<0.05)。上述研究结果提示:(1)瓣膜性房颤患者右心房组织HOTAIR表达下调,HOTAIR表达异常可能参与了房颤的发生;(2)HOTAIR正向调控小鼠心房肌细胞Cx43的表达;(3)miRNA-613明显减弱HOTAIR对小鼠心房肌细胞Cx43的正向调控作用,而HOTAIR则可部分挽救miRNA-613诱导的小鼠心房肌细胞Cx43下调,提示HOTAIR通过miRNA-613调控小鼠心房肌细胞Cx43的表达;(4)编码Cx43的GJA1是miRNA-613直接作用的靶基因,进一步证实HOTAIR通过与GJA1竞争结合miRNA-613,参与小鼠心房肌细胞Cx43表达的调控。结论 (1)HOTAIR下调可能在房颤的发生中起着重要的作用;(2)HOTAIR作为ceRNA,通过与GJA1竞争性结合miRNA-613,调控小鼠心房肌细胞Cx43的表达;(3)HOTAIR下调,与miRNA-613的结合能力减弱,miRNA-613与GJA1结合增加,对GJA1的负性调控作用增强,从而导致Cx43表达的下调,这可能是HOTAIR参与房颤发生的重要机制之一。