第一部分 致心律失常型心肌病基因型与临床表型关联研究研究目的本研究目的在于通过在我国建立致心律失常型心肌病(arrhythmogenic cardiomyopathy,ACM)人群队列,应用二代 DNA 测序技术(next-generation sequencing,NGS)对我国队列患者人群进行测序,揭示致心律失常型心肌病的基因型特征。同时,通过收集队列患者的基线资料和临床随访,总结ACM疾病发生发展的特征。最后,通过将我国和瑞士的国际合作,将两个不同的ACM队列合并,研究ACM基因型和临床表型的关系。研究方法中国和瑞士多中心的联合患者人群队列包括了 186例ACM先证者,其中中国队列由118例汉族ACM先证者组成,瑞士队列由68例高加索人种ACM先证者组成。中国和瑞士两个队列患者均通过NGS进行基因检测:在中国人群队列中我们检测了 66个心肌病或离子通道病基因,在瑞士队列中检测了 187个心肌病或离子通道病基因。其中,两个基因检测试剂盒均包含13个ACM相关基因(包括5个桥粒基因和8个非桥粒基因),均针对编码序列和剪接剪接区域进行了基因测序。本研究对13个ACM相关基因进行了生物信息学分析,发现疾病相关基因变异。对通过生物信息学分析发现的疾病相关基因变异通过一代测序进行验证。同时,我们收集了患者基线临床资料,并对患者进行前瞻性随访,并记录临床结局。主要终点事件定义为心脏移植或心衰死亡,次要终点事件定义为主要心律失常不良事件(major arrhythmic cardiac events,MACE),复合终点事件包括主要终点事件和次要终点事件。最后,我们对比了携带不同基因变异类型患者的临床特征及临床结局,通过Kaplan-Meier分析对比携带不同基因变异类型患者的结局事件差异,并通过Cox回归分析探索影响结局事件发生的基因变异因素。研究结果通过对比中国队列和瑞士队列的基线资料,我们发现中国队列患者诊断时出现左室累及比例较高(53%vs.38%,p=0.046),而且中国患者右室射血分数均值较低(23.6±12.4%vs.40.2±9.3,p<0.001)。此外,来源于两个队列的患者基因变异的分布也有所不同(p=0.014),其中中国患者队列中非桥粒基因变异携带者比例高于瑞士队列。在临床结局上,中国队列患者接受心脏移植的比例较高(42%vs.4%,p<0.001),而发生 MACE 比例较低(38%vs.57%,p=0.014)。在186例先证者中有96例(52%)患者携带基因变异。与没有进行心脏移植的患者相比,在进行了心脏移植的患者中PKP2变异携带率显著较低(22%vs.2%,p=0.001),而非桥粒基因变异携带率显著较高(5%vs.21%,p=0.001)。与没有发生MACE的患者相比,经历MACE的患者中桥粒基因携带率显著较高(46%vs.31%,p=0.035),尤其是PKP2变异携带率最为显著(26%vs.8%,p=0.001)。我们将性别、基因型信息放入多因素Cox回归模型中,结果表明非桥粒基因变异(HR=2.285,p=0.014)和多基因变异(HR=3.496,p=0.048)是心脏移植的独立危险因素,而PKP2变异是发生MACE的独立危险因素(HR=3.190,p<0.001)。对比携带变异与未携带变异的患者,我们发现携带变异患者出现心律失常性晕厥的比例较高(36%vs.21%,p=0.021),胸骨旁长轴右室流出道直径(40.0±8.8mm vs.36.3±7.8mm,p=0.006)和胸骨旁短轴右室流出道直径较大(41.3±8.6mm vs.37.7±7.7mm,p=0.005),携带变异的患者免于 MACE 的生存率(p=0.032)和免于复合终点事件的生存率(p=0.011)显著低于未携带变异的患者。对比携带桥粒变异和携带非桥粒基因变异的患者,我们发现携带非桥粒基因变异患者诊断时出现左室功能不全的比例较高(34%vs.61%,p=0.034),最终进行心脏移植的比例较高(21%vs.61%,p=0.001),疾病进程中安装植入式电转复除颤仪(implantable cardioverter defibrillator,ICD)的比例较低(52%vs.11%,p=0.002),但是免于心脏移植的生存率显著较低(p=0.005)。对比携带DSP、DSG2/DSC2和PKP2变异的患者,我们发现DSP变异患者在诊断时有更高比例的左室累及(91%vs.53%and17%,p<0.001),最终进行心脏移植的患者比例显著增高(55%vs.27%and 3%,p=0.001)。DSG2/DSC2变异患者右室舒张末容积更大(318.1±126.2ml vs.200.5±73.6ml and 211.1±97.3ml,p=0.011)。PKP2变异患者有更高的比例需要进行室性心动过速的射频消融(53%vs.23%and 9%,p=0.008),有更高的MACE发生率(73%vs.40%and 45%,p=0.027),因此免于MACE生存率较低(p=0.022);而PKP2变异患者有更好的免于心脏移植生存率(p=0.025)携带DSP、DSG2/DSC2变异的患者相对于携带PKP2变异的患者免于心脏移植或心衰死亡的生存率显著较低(p=0.025)。研究结论在ACM患者不同基因变异的患者有不同的临床特征和结局。PKP2变异引起明显的心律失常型心肌病表型,而DSP变异、非桥粒基因变异、多基因变异会让患者处于更高的左心累及风险,甚至心脏移植。第二部分PKP2隐性变异的致心律失常型心肌病发病早、心衰严重研究目的PKP2 变异是致心律失常型心肌病(arrhythmogenic cardiomyopathy,ACM)最常见的基因变异之一,多为常染色体显性遗传。携带PKP2变异的患者一般有明显的室性心律失常,而鲜有出现左心功能不全。本研究目的是通过联合DNA测序分析和RNA测序分析,检测内含子变异对外显子剪接的影响,在ACM中发现了 PKP2隐性变异,并描述了隐性PKP2变异ACM病人临床和病理组织学特征。研究方法本研究对27例进行心脏移植的ACM进行了全基因组测序和转录组测序。通过联合分析两种测序结果,我们发现了2例患者携带PKP2隐性变异。同时,对47例未进行心脏移植的ACM患者进行了对ACM相关基因的靶向捕获测序,观察隐性PKP2变异的情况。通过查阅病历,本研究收集了PKP 隐性变异ACM患者的临床基线资料,并对患者进行了随访分析。同时对携带隐性PKP2变异的ACM患者进行了家系筛查,并通过一代DNA测序对先证者家族成员进行了先证者特异性基因变异检测。我们对比了携带PKP2变异和携带单个杂合PKP2变异的ACM患者的临床特征,并对于进行心脏移植的携带隐性PKP2变异患者的心脏组织进行了免疫荧光和免疫印迹检测。研究结果在27例心脏移植的ACM患者中,我们发现了 2例患者携带PKP2隐性变异。其中一例患者携带2个内含子变异,分别导致了 1个外显子的跳跃和1个外显子的延长。在47例未进行心脏移植的ACM患者中,我们发现了 3例携带PKP2隐性变异的患者。在上述5例携带PKP2隐性变异的患者中,每个患者至少有一个PKP2截短变异。通过对比携带隐性PKP2变异的患者和携带单个杂合PKP2变异的患者的临床特征,本研究发现与携带PKP2单杂合变异的患者相比,携带PKP隐性变异的患者发病显著早(11.8±5.9岁vs.27.4±8.4岁,p<0.001),出现腹胀(40%vs.0,p=0.040)、双下肢水肿(60%vs.0,p=0.006)的比例显著较高。携带PKP2隐性变异的患者左室结构功能受损更加严重,表现为左室扩张的比例更高(40%vs.0.p=0.060),运动功能降低的比例更高(100%vs0,p<0.001),左室射血分数显著降低(27.4±9.8%vs.61.9±6.0%,p<0.001)。通过生存分析发现,携带PKP2隐性变异的患者免于心脏移植或死亡和MACE的生存率,显著低于携带PKP2单杂合变异的患者(p<0.001和p=0.003)。通过免疫印迹,我们发现在携带PKP2隐性变异的患者中,截短的PKP2并没有表达。通过免疫荧光染色,我们发现携带PKP2隐性变异的患者润盘结构并没有明显改变,但PKP2表达显著下降。研究结论通过对心脏移植ACM患者心肌组织样本的DNA测序和RNA测序联合分析,可以发现常规单纯DNA测序无法发现内含子区域变异而导致的异常剪接。通过这种方式,我们发现携带PKP2隐性变异ACM发病早且有严重的心力衰竭。这些发现将对ACM的临床基因检测和危险分层具有重要意义。第三部分TTN变异、肌节变异在致心律失常型心肌病中的临床与病理研究研究目的致心律失常型心肌病(Arrhythmogenic cardiomyopathy,ACM)是一种遗传性心肌病,其主要特征是心肌被纤维脂肪组织替代。级联蛋白(Titin,TTN)变异、肌节变异分别是扩张型心肌病(Dilated cardiomyopathy,DCM)和肥厚型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy,HCM)中常见的变异类型,但是我们发现TTN错义变异、肌节变异也是ACM中常见的变异。本研究目的在于描述携带TTN错义变异、肌节变异ACM病人临床和病理组织学特征。研究方法本研究对84例ACM患者进行了捕获测序分析,其中35例进行心脏移植的ACM进行了全基因组测序分析。对所有全基因组测序的ACM进行了 TTN变异分析,对进行了捕获测序的患者进行了肌节变异分析。对所有携带变异的ACM患者进行了家系筛查和先证者特异性基因变异检测。我们收集并总结了 ACM患者的临床基线资料,并对患者进行了随访。我们在35个进行了心脏移植的ACM患者的移植受体心脏进行定量病理计算。我们取移植心脏的左室前壁、左室侧壁、左室后壁、室间隔、右室前壁、右室后壁等6个部位,进行切片和马松染色。通过图像处理软件对心肌成分、纤维成分和脂肪成分进行定量分析,并与携带其他类型变异的患者进行了对比。此外,我们对于携带携带TTN变异和肌节变异患者进行了家系筛查和共分离分析。研究结果本研究在35例患者中发现11个患者携带TTN变异,其中均为错义变异,9例患者为杂合变异,2例患者为多基因变异。在所有患者中,我们并没有发现TTN截短变异。与携带桥粒基因变异的患者相比,携带TTN变异的患者发病较晚(31±13岁vs.17±3岁,P=0.049),心脏移植年龄较大(41±14岁vs.24±9岁,P=0.027),左室舒张末径更大(62±10mmvs.45±10mm,P=0.019),而右室流出道直径较小(34±14mm vs 50±15mm,P=0.046)。通过定量病理我们发现,与携带桥粒基因变异的患者相比,携带TTN变异的患者右室心肌成分较多(40.8±29.4%vs.13.8±11.0%,P=0.017),而右室脂肪成分较少(43.0±30.9%vs.66.9±18.5%,P=0.036)。此外,不携带变异的患者和携带TTN变异的患者在临床特征和病理特征方面并没有显著差异。通过家谱分析,我们发现所有携带TTN变异的家族成员均没有表现出ACM的临床表型,表明了 TTN变异的外显率极低。我们发现了 6例患者中发现了 7个肌节蛋白基因变异,所有携带肌节变异的患者均为确诊的ACM,肌节变异的基因为NEBL,MYH7,MYH6和TNNI3。通过生物信息学分析,这些变异在对照人群中均为低频变异,而且经生物信息学预测为致病性变异。在6例携带肌节变异的患者中,有3例患者携带PKP2变异。携带肌节变异的患者发生MACE的平均年龄为41.2±11.0岁。在家系分析中,我们发现所有的变异均没有出现共分离现象,这表明携带肌节变异外显率极低。研究结论TTN错义变异是ACM中较常见的变异,出现的比例很高。由于携带TTN错义变异的患者与不携带变异的患者在临床和病理上并没有显著的差异,并且TTN错义变异外显率极低,我们认为TTN错义变异在ACM的致病机制中没有重要意义。本研究在ACM队列中发现了肌节蛋白变异。尽管这些病人发生了很严重的心律失常事件,但是通过家族共分离分析发现肌节变异并不是导致ACM的主要基因变异。