近年来，由病毒引起的各种传染性疾病，如蓝耳病、猪瘟、口蹄疫等，给我国的养猪业带来了巨大的损失。如何控制和治疗病毒性传染病已成为困扰我国养猪业的的重大难题之一。干扰素(Interferon，IFN)是一类动物机体产生的多功能分泌蛋白，具有广谱抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等多种生物学功能。β干扰素(Interferonbeta，IFN-β)主要由成纤维细胞产生具有诱导细胞产生多种抗病毒蛋白、增强自然杀伤细胞的活性、增加抗原提呈细胞MHCI型分子表达以及抑制白细胞增殖等功能。但是，动物体内一般情况下不产生干扰素，即使在病毒的诱导下也仅产生极其微量的IFN，难以抵御病毒的感染。因此，本实验在体外对猪β干扰素克隆和表达，旨在能获得高表达量的IFN-β，并将之用于预防和治疗猪的病毒性疾病。 根据猪β干扰素的核苷酸序列，设计并合成了一对引物P1/P2。根据该基因的酶切图谱和表达载体多克隆位点的分析，在上游引物P1中加入了限制性内切酶EcoRI识别位点，去掉了IFN-β基因原有的信号肽和起始密码子，并增加一个对框碱基，以调整猪β干扰素基因和其融合的载体序列的阅读框架的正确；在下游引物P2中加入了限制性内切酶KpnI识别位点，并保留了原有终止密码子。为进行目的蛋白的分泌表达，本实验采用了毕赤酵母表达载体的α因子信号肽。此信号肽能引导目的蛋白离开细胞，分泌于培养基中，方便蛋白质提取与纯化。 本实验首先抽提了猪肝脏细胞的全基因组，以上述引物PCR获得了β干扰素基因成熟蛋白对应的序列，扩增长度517bp。经过克隆，鉴定后，将目的片断与表达载体pPICZαC分别经过EcoRI和KpnI双酶切，然后将酶切产物连接并转化大肠杆菌，得到重组表达质粒pPICZαC-IFNβ，并进行测序鉴定。结果显示目的片段已经正确插入表达载体pPICZαC。重组表达质粒pPICZαC-IFNβ经SacI单酶切处理后，电击转化感受态的毕赤酵母工程菌X33，转化菌液用冰山梨醇温育培养30min，涂布YPDS+ZeocinTM选择性培养基，置28℃温箱培养4～5天，结果获得多个单菌落。挑取单个菌落，先用BMGY培养基(含甘油)激活培养约24h，OD值d达2～6。收集菌液，3000rpm离心2min，弃上清。用BMMY培养基(含甲醇)重悬菌体，置摇床28℃、250rpm诱导表达。每24h添加一次甲醇，保持终浓度1.0％。诱导表达4天后，收集菌液，离心，取上清。取少量上清液进行SDS-PAGE电泳分析，可见一条分子量稍大于20Ku清晰蛋白条带，而空载体转化宿主菌的对照未发现特异的蛋白条带。表达产物进行Western-blotting分析，显示在稍大于20Ku处出现了一条特异的显色条带，表明表达产物是猪的β干扰素。取上述甲醇诱导表达后的上清液，先进行过滤除菌，然后用DMEM以4倍稀释成不同浓度后，移入预先培养好的Vero96孔细胞培养板，每孔100μL。每个浓度作6个重复，同时设置细胞对照和病毒对照，不加干扰素。培养过夜。用100μgL100倍TCID50 VSV攻毒，细胞对照孔不加病毒液。37℃、5％CO2条件下培养约24h至36h。待病毒对照孔出现完全细胞病变时，判断结果，并根据细胞的病变程度，按5分级制进行打分。50％细胞病变保护的稀释度中所含的干扰素量即为1个干扰素单位。 结果显示本研究成功地在重组毕赤酵母中表达出猪β干扰素，该表达蛋白能够干扰VSV病毒在Vero细胞上的复制，效价为1.05×106U/L。表明该蛋白在预防和治疗猪病毒性疾病方面具有潜在的应用价值。