出生缺陷病因复杂种类繁多,唐氏综合征(Down Syndrome, DS)是其中单一病因发生率最高、严重致愚的出生缺陷。该缺陷是由21号染色体多出一条即21号染色体三体(Trisomy 21,T21)所致。可导致胎儿宫内发育迟缓、流产死产,存活的患儿表现为中重度智力障碍,常伴有心脏、消化道等多系统畸形。DS在新生儿中的发生率为1/600-1/800,在我国,每位DS患者一生给家庭和社会造成的经济负担为80万人民币,每年新增加的DS患儿其生命周期的经济负担超过100亿元。由于DS临床上尚无有效治疗措施,产前干预研究受到十分关注,各种产前筛查方案不断推出,在过去40年,从孕妇年龄超过35岁作为筛选指标,到孕中期、孕早期血清学筛查结合超声结构筛查方案,筛查效能虽逐渐提高,但仍然不尽人意。随着第二代测序技术的发展,通过对母亲外周血cffDNA进行无创产前检测(Noninvasive prenatal testing, NIPT)的卓越效能让医学界为之一振,并成为当今产前诊断领域的前沿课题之一,且迅速在临床得到应用。随着其技术的改进及商业化的推动,NIPT对常见的三大常染色体综合征(T21、T18、T13)的检出率可达到或接近99%,对性染色非整倍体的筛查敏感性略低于其他三种常染色体三体,然而随之而来的是在人们高期望的热切目光中, 其不容忽视的假阳性及假阴性逐渐浮出水面,而使之不得不被定性为产前筛查而非产前诊断。但在当前NIPT的检测平台,高额的成本,报告周期长及不适宜临床操作等弊端也使其在产前筛查领域中遭遇尴尬。因此寻找并解决导致NIPT结果与胎儿核型结果不一致的原因,以及如何使之能在临床便捷应用无疑成为NIPT所需解决的关键问题。本课题以临床中出现的NIPT结果与胎儿核型不一致等病例为研究对象,将从两部分探讨其发生原因及解决办法。第一部分是针对NIPT T 21假阴性将带来漏诊T21患儿这类严重后果,因此我们将T21假阴性病例作为研究切入点,分析可能造成假阴性的原因以及采用何种方法来进一步降低假阴性。第二部分研究背景是基于性染色体非整倍体(Sex chromosome aneuploidy, SCA)核型种类很多,而其中患儿表型差异很大,有的表型(如47,XXX)甚至不影响患儿出生后的生活质量,但假阳性的出现往往会引发家庭的恐慌,尤其是在我国这种社会及家庭对生育质量要求如此之高的国家,甚至会出现不必要的选择性流产,因此我们将针对性染色体NIPT检测中所出现的假阳性来寻找其可能的原因及解决的办法。第三部分的研究背景是基于现行大规模平行测序(Massively parallel sequencing,MPS)的临床应用具有成本高、运行周期长及不利于临床广泛应用等缺点,而新的高通量半导体测序技术已被证明可用于胎儿非整倍体的非侵入性产前筛查,我们将应用该技术探讨何IonTorrent芯片更有效及更适合应用于产前检测。第一部分胎盘染色体嵌合对唐氏综合征无创产前检测的影响目的 探讨NIPTT21假阴性形成原因,为NIPT假阴性结果提供另一种解释。方法 利用QPCR检测胚胎特异性甲基化位点RASSFIA基因实现女性胎儿cffDNA定量,男性胎儿DNA含量根据Y染色体序列测定,检测此两例孕妇血浆中cffDNA含量；提取正常11个白细胞样本的基因组DNA作为正常对照(6个显示为正常对照),T21 DNA样本作为阳性对照。胎儿DNA来自胎儿心脏组织(HT)和肝脏组织(LT),胎盘DNA来源于胎盘脐带根部(RUC)、脐带中部(MUC)、胎盘胎儿面中部(CP)、胎盘母面中心(CMS)、胎盘母面边缘(EMS)。应用第二代测序技术进行测序,每个样本的21号染色体数量(CR)根据已发表文献算法,由21号染色体测序序列数目/总测序序列数目进行计算。T21嵌合比例利用下列公式计算：待测样本21号染色体CR值/对照样本21号染色体平均CR值×100%。结果 案例1cffDNA含量15.55%,胎儿及胎盘组织不同部位留样进行DNA测序,显示自脐带、胎盘胎儿面、胎盘母体面T21嵌合程度依次递减,脐带中段和脐带根部分别为90%和53%的T21嵌合。相比之下,胎盘中心、胎盘母面中心和胎盘母面边缘,其T21嵌合分别为23%、17%和21%。正常胎盘组织相似点取样,结果显示无T21嵌合。案例2cffDNA19.72%,胎儿肝脏、心脏及脐带中部、脐带根部及胎盘胎儿面、母体面组织T21嵌合程度亦呈依次递减,在脐带T21嵌合高于92%,相反,胎盘中心、胎盘母面中心和胎盘母面边缘,T21嵌合分别为76%、51%和2.3%。结论 1、母体血浆和/或胎盘嵌合可导致血浆中有效胎儿游离DNA含量偏低,导致NIPT假阴性结果。2、不同部位的胎盘嵌合以及不同嵌合程度会中和异常核型cffDNA释放到母血中的实际数量,使得异常核型cffDNA含量低于NIPT可检测范围,产生假阴性结果。第二部分 母体染色体嵌合对NIPT性染色体非整倍体检测的影响目的 人类性染色体非整倍体疾病(Sex Chromosome Aneuploidies, SCAs)与21-三体综合征(T21)、18-三体综合征(T18)、13-三体综合征(T13)同样常见。但是目前NIPT对SCAs检测灵敏度和特异性均低于T21、T18及T13,我们将探讨母体性染色体嵌合在NIPT SCAs与胎儿核型不一致中的影响,并寻求相应的解决方案。方法 建立一种快速测序染色体核型分析的方法,使用大规模平行测序技术行NIPT同时检测母体白细胞染色体嵌合程度。该方法经DNA模拟XXX和XO嵌合模型实验验证,并在回顾性NIPT SCAs与胎儿核型检测不相符的病例中进一步验证,同时以此方法评估母体嵌合在NIPT人群中的发生率。结果 NIPT中同时母体白细胞快速测序核型分析可发现X染色体低至5%的嵌合,这种不同程度的母体嵌合在XXX/XO DNA嵌合模型实验及回顾性NIPTSCAs与胎儿核型检测不相符的病例中得到验证,母体X染色体核型能够准确检测。随后的NIPT前瞻性研究中,我们发现187例NIPT SCAs日性患者中有16例(8.6%)是由于母体X染色体核型异常而掩盖了胎儿X染色体DNA片段的真实状况,从而导致NIPT SCAs假阳性的现象。结论 X染色体和Y染色体的NIPT检测,可通过整合母体血浆测序和母体白细胞测序的结果来大幅提高其准确度。在确定潜在胎儿SCA后,高比例的母体嵌合发生率则要求NIPT同时必须进行母体白细胞检测,从而降低母体嵌合所致的NIPT SCAs的假阳性。第三部分 四种Ion Torrent芯片对无创产前三体检测的效果比较目的 探讨在半导体测序平台上四种不同容量的Ion Torrent芯片在检测胎儿染色体非整倍体疾病中的表现,寻找更适合临床应用的Ion Torrent芯片。方法 我们将8个孕妇血浆DNA样品(四个正常胎儿的孕妇和四个T21胎儿的孕妇)在Ion Torrent PGM 及 Proton测序平台上分别用314/316/318/PI芯片进行测序,并对读段比对比例,相关系数,以及Phred质量评分等参数进行了数据计算比较。结果 所有的样品用任一种芯片都能够被正确检测,不同芯片在检测T21方面具有良好的一致性。四种芯片中,316芯片有最高的读段比对比例,相关系数,平均读长以及Phred质量评分,PI芯片检测质量尚不稳定。结论 研究表明所有的Ion torrent芯片都可用于胎儿非整倍体的无创产前诊断。在PGM平台上316芯片具有较高的检测效能,在Proton PI芯片需要对原始数据进行严格质控从而达到理想的检测质量。我们建议研究者根据实际样品的数目,结合标签技术选择合适的芯片。