噬菌体(bacteriophage,phage)是一类能侵染细菌的病毒,其结构简单、个体微小、数量庞大、分布广泛。噬菌体能特异性侵染并杀灭细菌,是一种潜在的抗菌因子,可用于预防和控制细菌感染,即噬菌体治疗(phage therapy)。除噬菌体颗粒外,噬菌体编码产物,如溶菌酶(lysozyme),在抗细菌感染方面也具有较大的应用价值。目前发现和研究最多的噬菌体为双链DNA(dsDNA)有尾噬菌体,而关于双链RNA(dsRNA)噬菌体的报道较少。迄今为止,完成全基因组测序的噬菌体超过1900株,其中dsRNA噬菌体仅有6株(phi6、phi8、phi12、phi13、phi2954和phiNN),且这6株噬菌体均为囊膜噬菌体(Cystoviridae),其宿主主要是植物细菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种革兰阴性杆菌,于环境中广泛分布。在临床上,该菌是一种常见的条件致病菌,也是导致院内感染的重要细菌之一。铜绿假单胞菌可通过固有耐药和获得性耐药等方式抵抗抗生素治疗,使得临床治疗铜绿假单胞菌感染尤为棘手,因此迫切需要在抗生素治疗之外寻找新的治疗方法。本研究以铜绿假单胞菌临床分离株PA038为宿主菌,于西南医院污水中偶然分离到一株能裂解PA038的dsRNA噬菌体phiYY,基因组测序和比较基因组学分析表明该噬菌体属于囊膜噬菌体。鉴于能裂解铜绿假单胞菌的dsRNA噬菌体还未见有报道,本研究分离的噬菌体phiYY为目前研究报道的第一株铜绿假单胞菌囊膜噬菌体,因此研究phiYY的相关信息具有重要意义。本课题将以噬菌体phiYY为对象进行进一步的研究。首先,通过实验鉴定其基本生物学特性,检测其裂菌能力。随后,体外表达和纯化phiYY编码的推定溶菌酶,检测该溶菌酶的活性及裂解谱。最后,我们设计了一种由phiYY和其他4种不同宿主谱的裂解性噬菌体组成的鸡尾酒(phage cocktail),对噬菌体鸡尾酒配方策略进行初步研究,以此提出一个新的噬菌体鸡尾酒设计策略。本研究主要实验内容和结果如下:1、一株双链RNA噬菌体的分离鉴定:以铜绿假单胞菌临床分离株PA038为宿主菌,于西南医院未经处理的污水中分离到一株能裂解PA038的噬菌体。电镜下观察该噬菌体为无尾噬菌体且氯仿试验结果表明该噬菌体为有囊膜的噬菌体。抽提噬菌体基因组并测序分析,发现其基因组为三节段dsRNA,证实其为囊膜噬菌体科的dsRNA噬菌体。目前,仅有6株囊膜噬菌体科的噬菌体被全基因组测序,其中大部分分离自美国的豆类植物,宿主为植物细菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae),而本研究中分离的噬菌体为第一株能裂解人类致病菌铜绿假单胞菌的囊膜噬菌体。比较基因组学分析和蛋白序列比对表明,该噬菌体与其他6株囊膜噬菌体在基因组序列上无明显相似性,但蛋白序列显示出一定的相似性;系统发生分析表明该噬菌体与其他6株囊膜噬菌体具有一定同源性,与噬菌体phi13亲缘性最近,因此按照囊膜噬菌体命名方式将其命名为phiYY。本研究选取自7个不同医院分离的233株临床铜绿假单胞菌和铜绿假单胞菌标准株PAO1作为试验菌株,鉴定phiYY的裂解谱,结果表明噬菌体phiYY能裂解99株(约40%)临床铜绿假单胞菌,属于裂解谱较宽的噬菌体。2、双链RNA噬菌体phiYY编码溶菌酶活性的研究:生物信息学分析表明噬菌体phiYY基因组的S片段上含有一个编码推定溶菌酶的基因(orf17)。分析该推定溶菌酶的蛋白序列,发现其含有两个结构域(溶菌酶样活性结构域和细胞壁锚定结构域),预测其作用位点可能为细胞壁肽聚糖(peptidoglycan,PG)上的β-1,4-糖苷键。将该溶菌酶基因与表达质粒进行重组后转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中,IPTG体外诱导蛋白大量表达并纯化。酶活性实验发现,该溶菌酶可直接裂解金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和外膜受损的铜绿假单胞菌,导致活菌数量出现1-4个数量级不等的减少,但对外膜完整的铜绿假单胞菌无直接杀伤作用。该溶菌酶活性的最适条件为37℃、pH 7.5-8,且低浓度的EDTA与溶菌酶联用能产生协同作用,提示其可作为一种潜在的抗菌制剂。3、噬菌体鸡尾酒配方策略的研究:噬菌体鸡尾酒是噬菌体治疗中常用的治疗制剂,其配方通常是选择两种及以上不同宿主谱的噬菌体混合组成。噬菌体鸡尾酒应用于临床治疗,也会产生类似抗生素耐受的情况,即噬菌体耐受。本研究考虑优化鸡尾酒配方设计,使得鸡尾酒具有更广谱的裂菌效能,同时能杀灭可能出现的噬菌体耐受细菌。本实验室在前期实验中以铜绿假单胞菌标准株PAO1为宿主菌,与噬菌体PaoP5相互作用后分离到耐受PaoP5的棕色耐受菌(PAO1r-1)和白色耐受菌(PAO1w-1)。测序发现PAO1r-1和PAO1w-1分别含有脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)合成关键基因galU和wzy的突变,导致菌株LPS分别出现O-抗原缺失和O-抗原截短。本研究通过不同方法筛选分离能裂解PAO1r-1和PAO1w-1的噬菌体,随后将其与其他3株宿主谱不同的裂解性噬菌体组合成噬菌体鸡尾酒并进一步评估其裂菌能力。通过定点噬斑实验,发现phiYY能有效裂解PAO1r-1,且通过PAO1w-1与PaoP5共培养,筛选到能裂解PAO1w-1的突变噬菌体PaoP5-m。为鉴定PaoP5-m是否为PaoP5的突变株及其突变位点,我们对其进行测序分析,结果表明其突变位点为基因orf75的A715C,随机挑取一株PaoP5-m进行后续实验,并将其命名为PaoP5-m1。将PaoP5、phiYY、PaoP5-m1和其他2株裂解性噬菌体(PaP1和PaP8)组合成噬菌体鸡尾酒进行后续实验。结果表明,相较于单个噬菌体,噬菌体鸡尾酒的裂解能力更强、宿主谱更宽且能有效的减少生物膜形成,并能在一定时间内减缓细菌的生长。鸡尾酒和PAO1长时间共培养后,随机挑取6个噬菌体耐受菌进行全基因组测序分析发现,耐受菌基因组均出现了两个及以上的基因突变。要出现两个基因的突变可能需要长时间的进化,表明本研究中设计的鸡尾酒在一定时间内也许能减少耐受菌产生的频率,减少噬菌体治疗中可能出现的噬菌体耐受,相较于单个噬菌体更适合应用于临床。综上所述,本研究分离了一株能裂解铜绿假单胞菌的dsRNA噬菌体phiYY,对其基本生物学特性进行了研究,通过基因组测序分析了解其遗传信息及特征,比较基因组学分析发现其与囊膜噬菌体phi13亲缘性最近。鉴于phiYY属于囊膜噬菌体,且有较宽的裂解谱(约40%,99/234),提示其存在潜在的研究和应用价值。本研究体外表达和纯化了phiYY编码的推定溶菌酶,实验证实其能直接裂解金黄色葡萄球菌和外膜受损的铜绿假单胞菌。最后本研究对于如何破解噬菌体治疗中可能出现的噬菌体耐受这一难题进行了初步探索。噬菌体phiYY与其他4株不同宿主谱的裂解性噬菌体组合而成的鸡尾酒制剂,显示出比单个噬菌体更宽的裂菌谱并能在一定时间内减缓细菌的生长,而减缓细菌生长的原因可能是减少了耐受菌出现的频率。